HPSE2基因表达载体的构建及其表达产物的分布研究

摘要

研究背景:Urofacial(Ochoa)综合征(UFS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。通过家系连锁分析及染色体外显子测序,HPSE2缺陷被证明是UFS的致病基因,但其机制还不完全清楚,对该基因的功能也多局限于生物信息学预测。
　　目的:利用生物信息学预测,HPSE2为分泌型蛋白可能性大,其N端38个氨基酸为分泌信号肽。本研究以EGFP为表达及鉴定标签,验证HPSE2基因在哺乳动物细胞内是否为分泌表达。
　　方法:利用重组PCR技术,在EGFP基因5′端加入包含有HPSE2分泌信号肽的CDS区(1~588bp),构建为HPSE2-EGFP-partial融合基因;构建5′端融合IgGκ分泌信号肽的EGFP融合基因IgGκ-EGFP,将两种融合基因克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)上,构建成pcDNA3.1(+)-HPSE2–EGFP-partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP表达质粒。以pEGFP-C3作为胞浆表达对照,pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP作为分泌表达对照,pEGFP-N1-HPSE2为阳性对照,并利用脂质体转染人胚肾Hek293T细胞,通过荧光显微镜及Western检测重组基因表达产物在细胞内外的分布。
　　结果:经酶切、PCR及测序鉴定,重组表达质粒pcDNA3.1(+)-HPSE2-EGFP-partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP构建成功,经荧光显微镜及Westernblot检测,证实HPSE2基因的表达产物分布在细胞内,所以此蛋白并非分泌型蛋白,这与2010年Levy-Adam,F提出的HPSE2是一种分泌型蛋白的结论完全相反。
　　结论:HPSE2蛋白的N端不包含分泌信号肽,其分布于胞浆中,且主要聚集于核周。

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主要英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1. 主要试剂和仪器

1.1 试剂

1.2 实验仪器

2. 实验设计与方法

2.1HPSE2-eGFP融合基因与IgGκ-eGFP融合基因的获得

2.2 表达质粒pcDNA3.1(+)-HPSE2-eGFP-Partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-eGFP的构建

2.3 传代细胞培养

2.4 Western-blot（蛋白质免疫印迹法）

结果

讨论

参考文献

综述

致谢

附录：攻读学位期间发表论文