TRPC氨基端在介导TRPC形成功能性同源和异源聚合体及Ca2+内流中发挥关键作用

摘要

瞬时受体电位通道TRPC(Transient receptor potential canonical)作为一种Ca2+非选择性的阳离子通道,在兴奋性细胞和非兴奋性细胞中广泛表达。TRPC在人体内表达6种,TRPC1,C3,C4,C5,C6,C7,TRPC2是一种假基因而不表达。这6种成员按照序列的同源性可划分为2个亚群:TRPC1,C4,C5为一个亚群,TRPC3,C6,C7为另一个亚群。功能性的TRPC通道有赖于4个单分子的TRPC亚基彼此聚合形成四聚体,这一点是由它与电压门控钾离子通道结构的相似性推导而来,并且在TRPC3的3D模型中得到证实。TRPC的这种聚合可发生在同种分子之间,形成同源聚合体,也可发生在不同成员之间,形成异源聚合体。异源聚合体又存在几种情况:(1)最早的研究证实,TRPC的聚合可发生在同一亚群内部,如TRPC1,C4,C5之间,或者TRPC3,C6,C7之间,两个亚群之间则不能交叉聚合;(2)此后,进一步的研究证实,TRPC1可作为一种连接分子,将两个不同亚群分子之间联系起来;(3)再后来,更多的研究证实,任意两种TRPC之间,无论同一亚群,或者不同亚群,均可相互结合。目前,普遍认为,所有的TRPCs均可形成同源聚合体,任意两种TRPCs之间均可形成异源聚合体。TRPC间的聚合具体发生在哪个片段,这方面的研究尚少,仅有少量的研究证实,TRPC4分子内部的自身结合是通过其N-末端的相互作用,对于其它分子的结合,目前尚无更多的研究验证其结合部位。另外,此前针对蛋白质分子之间结合的研究所使用的方法,一般都是免疫共沉淀CoIP,GST-pull down等,这些方法的缺陷在于,不能反映活细胞中蛋白表达及结合情况。
　　另一方面,TRPC通道的功能研究一直是近年来的热点,已有大量研究表明,TRPC作为一种Ca2+通道,它参与了受体介导的Ca2+内流(ROCE,receptor-operated calcium entry),以及该库操控的Ca2+内流(SOCE,store-operated calcium entry)两种机制。目前已知的TRPC3,C6,C7具有钆抵抗的特点,可产生钆抵抗的受体介导的Ca2+内流现象(Gd3+-resistant-ROCE),各种TRPCs均可产生Tg诱导的钙库操控Ca2+内流现象(Tg-induced-SOCE)。但与其功能相关的具体结构域,即TRPC分子上到底哪段区域对其功能性通道通透Ca2+发挥关键作用,这方面的研究尚不多。
　　本课题研究的目的在于,使用一种新方法双分子荧光互补实验BiFC,在活细胞中观察蛋白质分子之间的相互结合,进一步证实TRPC分子可以形成同源或异源结合。该方法通过在HEK293细胞中外源共表达两种完整TRPC-VN155/VC155,或者共表达一种完整TRPC-VN155/VC155和一种去除氨基端的TRPCΔN-VC155/VN155,通过激光共聚焦显微镜观察活细胞中荧光信号强度,对比二者之间的差异,从而验证N端对于TRPC分子间相互结合的作用。CoIP和WesternBlot作为一种补充手段,进一步验证N端在介导TRPC分子之间相互结合的作用。此外,采用Ca2+影像(Ca2+image)技术,测定TRPC3,C6,C7全长或去N端的突变体在ROCE现象中对Gd3+的反应,以及TRPC1,C4,C5全长或去N端的突变体对Tg-inducedSOCE的反应,以证实TRPC的N端在介导Ca2+内流中的重要性。
　　BiFC结果显示,共转两种完整TRPC-VN155/VC155所产生的荧光信号,比共转一种完整TRPC-VN155/VC155和一种去N端TRPCΔN-VC155/VN155所产生的信号明显较强。使用CoIP和WesternBlot,结果显示,myc-标记的TRPC-VN155可被HA-标记的TRPC-VC155共沉淀下来,在使用anti-myc抗体后出现阳性结果。而myc-标记的TRPC-VN155不能被HA-标记的TRPCΔN-VC155共沉淀下来,在使用anti-myc抗体后则出现阴性结果。该现象不仅在表达一种同源TRPC系统中出现,也在表达两种异源TRPC系统中出现。Ca2+image结果显示,表达完整TRPC3,C6,C7-VN155/VC155的细胞均表现出Gd3+-resistant-ROCE,而表达去N端的TRPC3,C6,C7ΔN-VN155/VC155的细胞该现象消失。表达完整TRPC1,C4,C5-VC155均表现出Tg-inducedSOCE现象,而表达去N端的TRPC1,C4,C5ΔN-VC155对Tg的诱导不产生反应。
　　综上所述,本实验进一步证明,任意一种TRPC均可形成同源聚合,任意两种不同TRPC之间均能形成异源聚合。无论同源或异源聚合,都需要N端存在。而TRPC通道正常发挥Ca2+通透的功能也需要N端的存在。可见,TRPC的N端在介导TRPC分子间形成同源或异源聚合体,以及介导Ca2+内流方面,均发挥关键性作用。

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英文缩略词表

中文摘要

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前言

实验材料

一、主要实验仪器

二、主要实验材料

三、主要试剂

四、主要液体配制

实验方法

一．质粒构建

二、细胞培养

三、转染

四、双分子荧光互补实验BiFC

五、细胞爬片

六、钙影像

七、免疫共沉淀（CoIP）

八、Western Blot

九、统计学分析

实验结果

第一部分 TRPC的氨基端在介导TRPC形成功能性同源或异源聚合体中发挥关键作用

一．TRPC的氨基端介导TRPC分子的同源聚合

三、TRPC的氨基端介导TRPC分子的异源聚合

第二部分 TRPC的氨基端在介导TRPC通道的Ca2+内流过程中发挥关键作用

讨论

参考文献

综述

致谢