HBV所致慢加急性肝衰竭患者外周血单个核细胞中微小RNAs表达谱的变化

摘要

研究背景:microRNAs(miRNAs)是一类大小约为22nt的小的非编码RNA分子,在动物体内大多数miRNA的生物合成过程是在RNA聚合酶II,核糖核酸内切酶IIIDrosha及Dicer的作用下产生的。miRNA在生物界中广泛存在。据推测动物体内大约1％--5%基因编码miRNA,正常细胞和肿瘤细胞都可以表达某种特定的miRNA。组织细胞内外的miRNA表达图谱是不一样的,miRNA可选择性地从组织细胞释放到外周血中,这种选择性机制及外周血miRNA的稳定性有利于miRNA成为疾病诊断的生物标志物。2008年Lawrie等在研究弥漫性大B细胞淋巴瘤病时,在病人血清中首先检测出miR-21[1].Li等首次将血清中miRNA作为生物标志物,对HBV感染及HBV阳性的肝细胞癌(HCC)作出诊断。在他们研究中发现miR-375、miR-92a是HBV感染特有的,而miR-25、miR-375、let-7f可作为HBV阳性的肝细胞癌诊断的生物标志物,且miR-375的特异性为96%,敏感度为100%[2]。陈[3]等人在研究中发现,HBV携带者与重型肝炎患者PBMC中差异性表达的miRNA共有17个,其中hsa-miRNA-1246等5个表达上调,hsa-miRNA-223,hsa-miRNA-547-3p,hsa-miRNA-150等12个miRNA表达下调,对这些差异性表达的miRNA初步分析,发现其中2个参与机体免疫调节,在12个低表达的miRNA中,miRNA-150和miRNA-223可能与病毒性肝炎的肝细胞炎症活动有关。其中miRNA-150主要参与调控B淋巴细胞的成熟,还通过调节Th1与Th2细胞的分化参与机体炎症反应[4]。
　　目的:本研究旨在探寻在HBV所致的慢加急性肝衰竭患者外周血单个核细胞中表达发生明显改变的miRNAs,从中寻找与肝衰竭发生发展相关分子纤维蛋白原样蛋白2/纤维介素(fibrinnogenlikeprotein2,fgl2),肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(tumornecrosisfactorreceptor/tumornecrosisfactorreceptor,TNF/TNFR1),死亡受体CD95/死亡受体CD95配体(Fas/FasL),干扰素-γ(interferon-gamma,INF-γ)、干扰素-γ诱生蛋白-10(INF-γinducibleprotein-10,CXCL10)、Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)相互作用miRNAs,探求HBV所致的慢加急性肝衰竭疾病的发生机制,从而为该疾病的诊断、治疗、预防提供新思路。
　　方法:分别收集了20例HBV所致的慢加急性肝衰竭患者和慢乙肝轻度患者的外周血标本,收集外周血单个核细胞(PBMC),利用miRNAmicroarray芯片,分析两组患者外周血单个核细胞(PBMC)中miRNAs表达谱系的变化,寻找表达水平显著改变(上调或下调超过2倍)的miRNA。同时又借助生物信息学靶标预测软件(TargetScan),找到与肝衰竭发生发展相关分子(hfgl2,Fas/FasL、TNF/TNFR1、IFNγ、CXCL10、TLR4)相互作用miRNAs,对基因芯片的结果进行初筛。为了进一步验证上述芯片结果的可靠性,我们采用了GeneCopoeia公司的All-in-One?miRNAqRT-PCRDetectionKit对初筛的4种microRNA分子表达情况进一步验证,U48是一种在各种细胞中表达较为稳定的RNA,在本实验中作为内参对照使用,所得的数据采用?ΔΔCT2方法进行计算,并对所得的结果进行了统计学分析。
　　结果:通过基因芯片并借助miRNA靶标预测软件(TargetScan),分析发现在HBV所致的慢加急性肝衰竭患者外周血混合单个核细胞中明显下调的microRNA有16个,其中,microRNA-181c、microRNA-30e、microRNA-1826、microRNA-107可能对肝衰竭发生发展相关的分子fgl2,Fas/FasL、TNF/TNFR1、IFNγ、CXCL10、TLR4起作用。在进一步验证中,我们发现microRNA-181c在HBV所致的慢加急性肝衰竭患者外周血混合PBMC中明显下调。
　　结论:与慢性乙型肝炎轻度患者相比,Hsa-microRNA-181c在HBV所致的慢加急性肝衰竭患者外周血PBMC中表达明显下调,并可能调控IFNγ、TNF、FasL的表达,可能与HBV所致的慢加急性肝衰竭疾病的发生发展有相关性。为HBV感染机制的阐明,以及HBV所致的慢加急性肝衰竭的预防和治疗提供帮助。

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材料与方法

1主要试剂

2主要仪器设备

3实验方法

结果

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综述

参考文献

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