胃癌中ER-α36与EGFR信号传导通路的研究

摘要

胃癌是世界上第四常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤的第二位。治疗以手术切除为主，效果不佳，5年生存率为26％。流行病学的调查显示，雌激素（estrogen）和胃癌发生有关。胃癌发病存在男女性别差异，男性约为女性的2～3倍，女性绝经期后与男性的这种差异消失。雌激素在胃癌发生发展中如何发挥作用目前还不清楚。
　　雌激素通过与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合发挥多种生理和病理效应。雌激素受体有四个亚型：ER-α66、ER-α46、ER-α36和ER-β。ER-α36是近年来新发现的一个雌激素受体，是ER-α66（即经典的ER-α）的剪切变异体。与全长的ER-α66比较，ER-α36缺少AF-1和AF-2两个转录激活区，但是保留了DNA结合区和部分二聚体化及雌激素结合区，并且在羧基末端有一个特异的由27个氨基酸组成的结构。目前的研究发现，ER-α36主要位于细胞膜和细胞浆，通过调节MAPK/ERK、PI3K/Akt等信号通路发挥雌激素的非基因组效应，在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。在ER阴性（即ER-α66阴性）的乳腺癌中的进一步研究表明，ER-α36与EGFR相互作用，激活MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路，促进乳腺癌细胞生长。
　　表皮生长因子受体（epithelial growth factorreceptor，EGFR）属于受体酪氨酸激酶家族成员之一。活化的EGFR可以激活MAPK/ERK、PI3K/Akt等信号通路，将细胞外的有丝分裂信号传导到细胞内，从而调节细胞的生长、增殖、分化、粘附以及迁移等活动。EGFR在包括胃癌在内的多种肿瘤细胞中过表达。
　　以前的研究发现，胃癌低表达 ER-α66（2～28％）和ER-β，由此认为胃癌是非雌激素依赖的肿瘤。本课题组在前期的研究中已经发现，在胃癌细胞株BGC823、SGC7901、AGS、MKN45中均可检测出ER-α36mRNA和ER-α66mRNA，且ER-α36表达量高于ER-α66。ER-α36 mRNA在癌组织中的表达量要高于癌旁组织和正常组织，ER-α66 mRNA的表达量则呈现相反的趋势。这提示ER-α36在胃癌细胞中发挥的作用可能大于ER-α66。
　　但是，ER-α36在胃癌中所发挥的作用机制并不清楚。在胃癌细胞中，ER-α36是否和乳腺癌中一样，与EGFR存在相互作用从而激活相关信号通路？为解决这个问题，本研究设计三个实验。
　　第一部分：胃癌组织中ER-α36蛋白的表达与临床病理特征关系的研究。搜集存档的人体胃癌组织标本蜡块，构建组织芯片，运用免疫组织化学染色方法检测ER-α36蛋白的表达，评价其临床病理意义。
　　第二部分：胃癌组织中ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白的表达及其相互关系的研究。利用新鲜冰冻的人体胃癌组织，用Western blot方法检测ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白的表达及其相互关系。从组织水平研究胃癌中ER-α36是否和EGFR-ERK信号转导通路有关。
　　第三部分：胃癌细胞中ER-α36与EGFR信号传导通路关系的研究。构建胃癌细胞SGC7901稳定高表达ER-α36（SGC7901-High36）和低表达ER-α36的重组细胞株（SGC7901-Low36）。用EGF作用于正常、高表达ER-α36、低表达ER-α36的胃癌细胞SGC7901，Western blot方法检测三种细胞中P-ERK蛋白的表达。从细胞水平研究胃癌中ER-α36是否和EGFR-ERK信号转导通路有关。
　　第一部分 胃癌组织中ER-α36蛋白的表达与临床病理特征关系的研究
　　目的：检测胃癌组织中ER-α36蛋白的表达情况及其与各项临床病理特征关系。方法：应用组织芯片技术制作67例胃癌组织芯片，4μm连续切片2张分别进行HE染色和免疫组织化学染色。观察组织芯片可供分析病例中ER-α36蛋白的表达情况，并分析其与各项临床病理特征的关系。结果：制作的67例胃癌组织芯片经免疫组织化学染色后可分析病例为53例，可分析率79.1％。胃癌组织中存在ER-α36蛋白的表达，主要定位于细胞膜和细胞浆。有33例胃癌组织表达ER-α36蛋白，阳性表达率62.3％。ER-α36蛋白在肠型胃癌的表达比弥漫/混合型胃癌高，与性别、年龄、肿块大小、浸润深度、淋巴结转移等病理学指标无关。结论：胃癌组织中存在ER-α36蛋白的表达，阳性表达率62.3％（33/53）。肠型胃癌中ER-α36蛋白表达更高。
　　第二部分 胃癌组织中ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白表达相互关系的研究
　　目的：研究胃癌组织中ER-α36与EGFR、P-ERK蛋白表达相关性。方法：用Western blot方法检测24例新鲜冰冻的人体胃癌组织中ER-α36、EGFR和P-ERK蛋白的表达。结果：24例胃癌组织中，ER-α36蛋白阳性表达率为75％（18/24），EGFR蛋白阳性表达率为70.8％（17/24），P-ERK蛋白阳性表达率为58.3％（14/24）。ER-α36蛋白阳性表达的胃癌病例组中EGFR蛋白阳性表达率（88.9％，16/18）高于ER-α36蛋白阴性表达病例组（16.7％，1/6），差异有统计学意义（P＜0.01）；EGFR蛋白阳性表达的胃癌病例组中ER-α36蛋白阳性表达率（94.1％，16/17）高于EGFR蛋白阴性表达病例组（28.6％，2/7），差异明显（P＜0.01），表明ER-α36表达和EGFR相关。ER-α36蛋白阳性表达的胃癌病例组中P-ERK蛋白阳性表达率（72.2％，13/18）高于ER-α36蛋白阴性表达病例组（16.7％，1/6），差异有统计学意义（P＜0.01），表明ER-α36表达和P-ERK相关。EGFR蛋白阳性表达的胃癌病例组中P-ERK蛋白阳性表达率（76.5％，13/17）高于EGFR蛋白阴性表达病例组（14.3％，1/7），差异明显（P＜0.01），表明EGFR表达和P-ERK相关。在13例EGFR和P-ERK蛋白同时阳性的病例中，ER-α36蛋白阳性率为92.3％（12/13），13例ER-α36和P-ERK蛋白同时阳性的病例中，EGFR蛋白阳性率也为92.3％（12/13），ER-α36、EGFR、P-ERK的表达相关。结论：ER-α36与EGFR-ERK通路相关。
　　第三部分 胃癌细胞中ER-α36与EGFR信号传导通路关系的研究
　　目的：研究胃癌细胞中ER-α36与EGF刺激的EGFR-ERK信号传导通路的关系。方法：用慢病毒转染的RNA干扰技术构建胃癌细胞SGC7901稳定高表达ER-α36（SGC7901-High36）和低表达ER-α36的重组细胞株（SGC7901-Low36）。用EGF作用于正常、高表达ER-α36、低表达ER-α36的胃癌细胞SGC7901，Western blot方法检测三种细胞中P-ERK蛋白的表达。结果：EGF作用于SGC7901细胞后，P-ERK蛋白的表达与EGF有浓度和时间依赖的关系。EGF作用于高表达ER-α36的SGC7901细胞后，P-ERK蛋白高表达；作用于低表达ER-α36的SGC7901细胞后，P-ERK蛋白低表达。结论：胃癌细胞中ER-α36通过EGF刺激的EGFR-ERK信号传导通路发挥促进细胞生长的作用。

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前言

参考文献

第一部分 胃癌组织中ER-α36蛋白的表达与临床病理特征关系的研究

参考文献

第二部分 胃癌组织中ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白表达相互关系的研究

参考文献

第三部分 胃癌细胞中ER-α36与EGFR信号传导通路关系的研究

参考文献

课题小结

创新点

研究展望

综述雌激素受体与胃癌的研究进展

致谢