重组血栓调节蛋白N端结构域抑制肝组织损伤的研究

摘要

本文主要分三部分展开研究：
　　第一部分 原核表达并纯化血栓调节蛋白N端结构域和HMGB1
　　目的：原核表达并纯化纯度较高的血栓调节蛋白N端结构域和HMGB1，获得相应蛋白。
　　方法：取正常小鼠肝组织提取总RNA作为模板，根据目的基因的要求，设计两对引物，经RT-PCR转录出血栓调节蛋白N端结构域和HMGB1基因片段并扩增；两种基因片段与PMD-18T克隆载体的连接，构建克隆载体PMD-18T-TM-N和PMD-18T-HMGB1，经专业生物公司测序确定后；分别转化至大肠杆菌E.coli DH5a，大量克隆并提取，双酶切后，分别与同样双酶切之后的表达载体PET-28a连接，得到带6-His标签的表达载体PET-28a-TM-N和PET-28a-HMGB1，测序正确；分别转化至大肠杆菌BL21，分别用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（ITPG）诱导，Ni2+-NTA树脂层析柱纯化得到目的蛋白（TM-N为包涵体，逐步透析降低尿素浓度，使之自动折叠复性）。
　　结果：得到TM-N与HMGB1基因的原核表达质粒PET-28a-TM-N和PET-28a-HMGB1，双酶切、PCR、测序得知各基因均正确的插入到原核质粒中；诱导纯化分离得到的蛋白经SDS-PAGE检测证明为TM-N与HMGB1蛋白。
　　结论：成功得到PET-28a-TM-N与PET-28a-HMGB1，并得到重组TM-N与HMGB1蛋白。
　　第二部分 重组蛋白在小鼠肝衰竭模型中的作用
　　目的：研究HMGB1对小鼠肝脏的损伤作用及作用通路；研究血栓调节蛋白N端结构域在小鼠肝衰竭模型中的作用。
　　方法：
　　1.C57BL普通小鼠随机分为3组，以下药物均腹腔注射：对照组：D-Galn600mg/kg、LPS5μg/kg；实验组：HMGB1150μg/kg；空白组:等量生理盐水。分别于2、6、12、24h经眼眶取血，取血后颈椎脱臼处死，取肝组织固定12 h，制成石蜡切片HE染色。免疫组织化测肝组织中HM GB1的表达、免疫荧光法检测肝组织N F-κB、RT-PCR测HMGB1-mRNA变化趋势、ELISA测血清ALT、TNF-α，HMGB1。配对t检验进行统计学处理。
　　2.TLR4基因敲除小鼠按1.方法分组、注射药物、取肝组织和血清及检测。
　　3.构建普通小鼠肝衰竭模型，腹腔注射重组TM-N，余按照1.方法进行。
　　结果：
　　1.在普通小鼠中：腹腔注射D-Galn和LPS的对照组和腹腔注射HMGB1的实验组均出现严重的肝组织坏死，免疫组化和RT-PCR可知肝组织内均有HMGB1的大量表达，血清内HMGB1也均明显升高（24小时对照组为189.91±21.31ng/ml，实验组为234.25±17.03ng/ml），远高于空白组（1.99±0.85ng/ml）；血清内ALT均明显升高（12小时峰值对照组为144.27±20.37U/L，实验组为127.42±11.05U/L），远高于空白组（9.19±3.57U/L）。免疫荧光检测NF-κB也显示，对照组与实验组均出现明显表达。
　　2.在TLR4基因敲除小鼠中：腹腔注射D-Galn和LPS的对照组与注射盐水的空白组一样，肝组织完全正常，组化切片和RT-PCR可知肝组织内仅细胞核内少量表达HMGB1，细胞浆无HMGB1表达，血清内ALT和HMGB1也无升高；注射HMGB1的实验组出现严重的肝组织坏死，肝损伤作用但较普通小鼠实验组肝损稍轻；组化切片和RT-PCR可知肝组织内均有HMGB1的大量表达，血清内HMGB1（对照组峰值为24小时194.63±12.74ng/ml）和ALT（对照组峰值为12小时157.36±23.79U/L）较空白组均明显升高。
　　3.腹腔注射rTM-N，肝组织HE染色显示实验组肝损伤明显减轻，免疫组化检测HMGB1和TM均显著少于对照组；免疫荧光检测NF-κB显著少于对照组。PCR检测肝组织 HMGB1-mRNA，实验组各个时间点表达水平明显低于对照组，12h峰值为98.44±13.69倍远低于对照组的200.54±24.57倍（P<0.05）；实验组各个时间点 TM-mRNA水平也明显低于对照组，12h峰值为21.46±2.79倍远低于对照组的58.63±5.78倍（P<0.05）。实验组血清中各时间点ALT、TNF-α和HMGB1的水平明显低于对照组，实验组ALT、TNF-α和HMGB1峰值分别为68.33±10.29（24小时）、355.42±53.55（12小时）和64.38±4.92（24小时），显著低于对照组，分别为127.42±11.05（12小时）、634.23±35.18（6小时）和234.25±17.03（24小时），P<0.05。
　　结论：1.HMGB1和LPS一样，也可以激活NF-κB及其下游通路，导致普通小鼠肝脏严重的损伤；
　　2.LPS不能导致TLR4基因敲除小鼠的肝损伤，提示LPS主要通过TLR4受体发挥；
　　3.TLR4受体的敲除，对于HMGB1的致炎作用影响并不大，因此HMGB1同样能导致TLR4基因敲除小鼠严重的肝损，推测 HMGB1的致炎作用通路可能主要为RAGE受体。
　　4.rTM-N能够减少HMGB1、TM和NF-kB的分泌，减少肝衰竭中血清谷丙转氨酶含量，改善肝功能，减小肝组织损伤，降低血管内皮损伤程度。
　　第三部分 重组TM-N蛋白在体外的抗炎作用
　　目的：观察重组TM-N蛋白在体外的抗炎作用。
　　方法：用LPS或rHMGB1刺激小鼠肝窦内皮细胞，加入不同浓度血栓调节蛋白N，CCK8法检测不同时间点细胞活力；免疫荧光检测细胞内HMGB1、TM和NF-κB；ELISA法细胞上清中TNF-α的含量；RT-PCR检测HMGB1-mRNA或 TM-mRNA相对空白组变化趋势。
　　结果：CCK8实验表明：LPS的刺激下，2小时各组细胞活力几乎是一致,各组无统计学差异（P>0.05），随着时间的推移，实验组各时间点细胞活力始终均大于对照组，rTM-N浓度为100ng/ml时能够使细胞活力持续维持在90％以上，48 h时实验组细胞活力为92.825％±2.42％，对照组为65.24％±3.79％（P<0.05）,rTM-N浓度越大细胞活力有所减少，但均大于80％；在rHMGB1的刺激下，实验组细胞活力始终大于对照组，rTM-N浓度越大活力越大，rTM-N浓度为1ug/ml时能够使细胞活力维持在85％以上,48h细胞活力实验组为84.33％±3.69％，对照组为51.635％±2.55％，细胞活力明显提高，有统计学差异（P<0．05）。
　　免疫荧光实验中，在LPS刺激下，镜下观和IOD值都提示，实验组细胞中NF-kB、HMGB1或 TM较对照组分布减少，颗粒荧光减弱。RT-PCR显示实验组细胞HMGBl-mRNA或TM-mRNA表达减少。
　　结论：因此rTM-N可以减轻LPS或HMGB1对细胞的毒性作用、增强细胞活性。LPS能够刺激小鼠肝窦内皮细胞产生大量的HMGB1，加入rTM-N蛋白能够减少LSEC分泌HMGB1、TM及NF-KB,减轻内皮细胞的损伤程度。

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封面

声明

目录

英文和中文对照

中文摘要

英文摘要

前言

技术路线（体内实验）

第一部分原核表达并纯化血栓调节蛋白N端和HMG B1

前言

一 材 料

二 方 法

三 结 果

四 讨 论

五 参考文献

第二部分重组蛋白在小鼠肝衰竭模型中的作用

前言

第（一）节HMGB1对TLR4 基因敲除小鼠作用

一、材料

二 、实验方法

第（二）节TM-N对肝衰竭模型小鼠的作用

一 材料

二 实验方法

三 结 果

四 讨 论

参考文献

第三部分重组TM-N蛋白在体外的抗炎作用

前言

一 材料和方法

二 结 果

三 讨 论

参考文献

综述 高迁移率蛋白B1和血栓调节蛋白在炎症中的作用及机制

参考文献

附录

致谢