水稻OsCPK9基因的表达分析、表达载体构建及遗传转化研究

摘要

水稻是重要的的粮食作物,也是分子生物学研究中的模式作物。由病原菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病(riceblast)是严重影响水稻品质和产量的病害之一,频繁施用农药难以奏效且易带来环境污染,而强化抗逆机能,培育高抗品种是解决这些作物病害问题的根本技术对策。水稻钙依赖型蛋白激酶(CDPK)基因家族在应对多种生物和非生物胁迫中具有重要作用,并已发现稻瘟病病原菌侵染能特异地诱导水稻CDPK基因家族中一个成员OsCPK9的上调表达。为明确OsCPK9的功能,本研究对不同抗性水稻品种OsCPK9基因在各种处理下的表达变化及OsCPK9亚细胞定位进行了初步分析;同时构建了OsCPK9基因过表达和RNA干扰载体,并进行了水稻遗传转化的研究,具体研究结果如下:
　　(1)通过对三种不同抗性材料的水稻品系接种稻瘟病菌和水杨酸(SA),茉莉酸甲酯(MeJA)激素处理,发现OsCPK9基因参与了SA、MeJA的抗病信号传导途径,而且位于抗病信号传导途径的上游,对稻瘟病的侵染有早期响应;
　　(2)利用基因枪转化法,将成功构建的用于亚细胞定位的融合蛋白表达载体质粒pBI121-OsCPK9-GFP,转入洋葱内表皮细胞中,瞬时表达结果表明,目的基因表达的蛋白主要定位于细胞核与质膜上;
　　(3)成功构建了目的基因OsCPK9的过量表达载体pSN1301-OsCPK9,RNAi表达载体pSN1301-RNAi;
　　(4)通过农杆菌侵染水稻野生型日本晴愈伤组织法进行水稻遗传转化,成功获得了空载体、过量表达和RNA干扰的转基因株系;
　　(5)通过分子鉴定和GUS组织化学染色法鉴定,成功获得了转基因阳性株系:空载体10株、过表达30株和RNAi10株;进一步通过半定量PCR方法获得OsCPK9基因表达量与野生型基本一致的空载体转基因株系2株,OsCPK9基因表达量较野生型高的过表达株系2株,OsCPK9基因表达量较野生型低的RNAi株系2株。
　　上述研究结果为深入了解OsCPK9在水稻抗稻瘟病反应中的功能奠定了基础。

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1 绪 论

1.1 CDPKs概述

1.2 OsCDPK概述

1.3 OsCPK9概述

1.4 稻瘟病

1.5 水杨酸和茉莉酸

1.6 抗病基因

1.7 研究目的及意义

2 基因表达的初步研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

3 亚细胞定位分析研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

4 水稻OsCDK9基因表达载体的构建

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

5 转基因再生植株的获得和阳性植株的鉴定

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结

6 总结与展望

6.1 总结

6.2 展望

致谢

参考文献