结构光照明超分辨微分干涉相衬显微成像技术

摘要

微分干涉相衬(Differentialinterferencecontrast,DIC)显微镜,是60年前发展起来的用于观察未染色透明的生物样品(相位样品)。目前,其已经成为使用最广泛的显微成像技术中的一种技术,且在生物医学研究领域具有广泛的应用。DIC成像技术是将样品中相位梯度的变化转化为强度变化,并且由两束横向上有略微距离(几百纳米)的光干涉产生相位的一阶导数信息。对比于荧光显微成像技术,DIC显微镜具有非侵入性和无需样品标记或染色的优点,可以允许人们观察没有处理过的“天然”的样品,在实际应用中很有意义。而对比于相衬显微镜,DIC显微镜具有以下优点:高空间分辨率;无光晕伪像;光学层析能力。然而,作为一种远场光学显微镜,DIC显微镜的空间分辨率受到了光学成像中衍射法则的限制,这使得许多小于衍射极限的生物结构在DIC成像中不可分辨。因此,为了观察更加精细的结构并且理解它们的功能,提高DIC成像的空间分辨率(打破分辨率衍射极限)显得极为重要。
　　我们提出了一种打破分辨率衍射极限的DIC成像技术,称之为结构光照明DIC(structuredilluminationDIC,SI-DIC)显微镜。此技术的物理思想是将结构光照明的观念应用于传统的DIC显微镜来扩宽DIC成像系统的相干传递函数(coherenttransferfunction,CTF)的带宽,从而使重构得到的DIC图像的分辨率明显优于传统DIC显微镜的成像分辨率。接着,我们进一步发展了结构光照明超分辨DIC成像技术,提出了基于空间光调制器DIC的结构光照明成像技术。此技术在实现超分辨DIC成像的同时,具有结构相对简单且DIC的重要参数(剪切方向、大小及基延迟)很容易变换的优点。
　　本文取得的主要创新研究结果如下:
　　(1)提出了结构光照明DIC超分辨显微成像技术。发展了结构光照明DIC成像理论,并通过计算机仿真的方法,验证了提出的结构光照明DIC成像理论。设计并建立了结构光照明DIC超分辨显微成像系统。使用数值孔径为0.8的聚光镜与物镜,以53nm聚苯乙烯小球样品,测量系统成像分辨率,获得了190nm的成像分辨率,打破了传统DIC成像分辨率衍射极限(380nm)。较传统DIC成像,结构光照明DIC成像的分辨率提高了两倍。并使用结构光照明DIC成像系统观察了生物样品(人脐静脉内皮细胞),同样获得了超分辨的实验结果,展示了此技术在生物学方面的应用。
　　(2)提出了基于空间光调制器DIC的结构光照明成像技术。研究了基于空间光调制器的DIC成像原理,建立了基于空间光调制器DIC的结构光照明成像系统。由于空间光调制器的灵活性,应用此成像系统可以方便地获得各种DIC重要参数(剪切方向、大小及基延迟)的DIC成像结果。使用数值孔径为0.8的聚光镜与物镜,以53nm聚苯乙烯小球样品,测量基于空间光调制器DIC的结构光照明成像系统分辨率,获得了211nm的成像分辨率,同样打破了DIC成像分辨率极限。较基于空间光调制器的DIC成像(435nm),基于空间光调制器的DIC结构光照明成像的分辨率提高了两倍。

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1 绪论

1.1微分干涉相衬显微成像技术及其研究进展

1.2结构光照明超分辨成像研究进展

1.3本文主要内容与文章结构

2 结构光照明超分辨荧光显微成像

2.1引言

2.2结构光照明超分辨荧光显微成像物理原理

2.3结构光照明超分辨荧光显微成像计算机模拟

2.4结构光照明超分辨荧光显微成像实验研究

2.5图像采集软件

2.6讨论

2.7本章小结

3 结构光照明超分辨DIC显微成像

3.1 引言

3.2 结构光照明超分辨DIC成像理论

3.3 结构光照明超分辨DIC计算机模拟

3.4 结构光照明超分辨DIC实验研究

3.5 讨论

3.6 本章小结

4 基于空间光调制器的DIC结构光照明超分辨显微成像

4.1 引言

4.2 基于空间光调制器的DIC成像原理

4.3 双光栅编程

4.4 基于空间光调制器的DIC实验研究

4.5 基于空间光调制器的DIC结构光照明实验研究

4.6 讨论

4.7 本章小结

5 总结与展望

5.1 本文的主要内容和研究结论

5.2 本文的主要创新之处

5.3 展望

致谢

参考文献

附录1 DIC成像理论模型

附录2 作者攻读博士期间发表的论文