纳米氧化锌与氯化镉联合作用对人肝癌HepG2细胞的毒性行为研究——结合代谢组学与细胞毒性分析方法

摘要

背景：随着纳米氧化锌（ZnO NPs）的规模化生产和普及，其在人群或环境中的暴露机会将大大增加，对其生物安全性的研究也刻不容缓。大量致力于ZnO NPs在分子、细胞、组织以及动物水平的毒理学研究，均是基于ZnO NPs与生物体的直接相互作用。ZnO NPs由于其特殊的表面效应，极易与环境中的各种有毒金属离子结合，形成稳定的金属-ZnO NPs复合物，也将不可避免的发生复杂的联合毒性效应。而目前有关与环境污染物共存的ZnO NPs对周围环境生物的间接毒性效应以及对其产生的细胞内代谢物的动态变化影响，至今尚无相关研究。
　　目的：(1).探讨纳米氧化锌(ZnO NPs)与氯化镉(CdCl2)之间理化性质的相互作用；
　　(2).探讨ZnO NPs与CdCl2联合诱导HepG2细胞的毒性效应；
　　(3).探讨基于GC-MS的代谢组学研究用于ZnO NPs与CdCl2联合诱导HepG2细胞凋亡的毒性机制。
　　方法：采用动态光散射技术(DLS)和扫描电子显微镜技术(SEM)观察CdCl2对ZnO NPs的粒径及表面性状的影响；采用火焰原子吸收分光光度仪(AAS)研究ZnO NPs对CdCl2的表面吸附作用；采用透射电子显微技术(TEM)来观察HepG2细胞对ZnO NPs的细胞内吞作用及可能产生的病理形态；采用CCK-8比色法、中性红(NRU)摄入法及LDH释放法来研究ZnO NPs与CdCl2联合诱导对HepG2细胞的细胞活性影响；运用流式细胞检测仪，DCFH-DA（2’-,7’-dichlorodihydrofluorescein-diacetate）作为荧光探针，对ZnO NPs与CdCl2单独及联合作用下HepG2细胞内ROS含量进行检测；运用碱性彗星实验（alkaline comet assay）检测ZnO NPs与CdCl2单独及联合作用引起的DNA断裂损伤；运用流式细胞检测仪检测ZnO NPs与CdCl2单独及联合作用对HepG2细胞早期凋亡与晚期凋亡的影响；采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）来检测ZnO NPs与CdCl2单独及联合作用所引起的细胞内源性代谢物的动态变化。
　　结果：DLS、SEM与火焰原子吸收的结果显示，与单一的ZnO NPs比较，添加CdCl2能够诱导ZnO NPs发生聚集，改变颗粒表面性质，从而影响ZnO NPs在水溶液中的粒径分布，并且随着ZnO NPs浓度的增加，其对Cd2+的物理吸附能力变大。TEM结果显示，HepG2细胞经ZnO NPs处理后会出现细胞膜破损，细胞核分解、染色体凝聚等凋亡现象；CCK-8实验、NRU实验与LDH实验结果表明ZnO NPs与CdCl2对HepG2细胞活性均有抑制作用，且两者的联合作用表现出协同毒性效应；析因分析结果显示ZnO NPs与CdCl2对HepG2细胞的氧化应激，DNA损伤及细胞凋亡等毒性作用均表现出一定的剂量依赖关系，而ZnO NPs的混合染毒液对HepG2也显示出一定协同毒性作用。细胞代谢组学研究发现ZnO NPs与CdCl2的联合诱导可引起细胞内代谢物发生显著性变化，并严重干扰细胞内柠檬酸循环途径（TCA），糖酵解途径，磷酸戊糖途径(PPP),脂肪酸生物合成途径，氨基酸及核酸代谢途径等。
　　结论：ZnO NPs对CdCl2有明显的吸附作用，从而影响颗粒的表面性质；ZnO NPs可与细胞表面发生相互作用，并在体内蓄积，诱导凋亡连锁反应；ZnO NPs与CdCl2的单独与联合作用均可诱导HepG2细胞活性抑制、氧化应激、DNA损伤及细胞凋亡，析因设计结果表明两者的毒性作用存在协同作用；首次采用基于GC-MS的代谢组学分析方法来找出ZnO NPs与CdCl2联合作用引起细胞内代谢途径紊乱的内源性标志代谢物，为完善ZnO NPs的毒理学评价和了解环境中ZnO NPs与CdCl2之间的毒性效应机制提供理论基础和实验依据。

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前言

第一部分 纳米氧化锌(ZnO NPs)与氯化镉(CdCl2)之间理化性质的相互作用

1.材料与方法

2.实验结果

3.实验讨论

第二部分 ZnO NPs与CdCl2联合诱导HepG2细胞的毒性效应研究

1.材料与方法

2.实验结果

3.实验讨论

第三部分 基于GC-MS的代谢组学用于研究ZnO NPs与

1.材料与方法

2.实验结果

3.实验讨论

全文总结

参考文献

综述

致谢