中国红豆杉bZIP类转录因子和TcNPR1基因克隆与功能研究

摘要

紫杉醇是一种高效抗肿瘤药物，对治疗卵巢癌、子宫癌等多种癌症具有显著效果。红豆杉细胞培养生产紫杉醇是扩大紫杉醇药源的有效途径之一，但产量不稳定是限制其产业化的瓶颈问题。前期研究发现水杨酸（SA）诱导包括紫杉醇关键酶紫杉二烯合酶ts基因在内的多个合成基因表达，并使得紫杉醇含量增加。bZIP（basic region/leucinezipper motif）类转录因子和NPR1（nonexpressor of pathogenesis-related genes1）是SA信号途径中的重要作用因子。本文拟克隆中国红豆杉细胞中的bZIP类转录因子和TcNPR1基因，并对其功能进行研究，为探究红豆杉细胞响应SA诱导大量合成紫杉醇的合成信号途径打下基础。取得的主要研究结果如下：
　　1)从中国红豆杉细胞中克隆得到了4个bZIP类转录因子。生物信息学比对发现它们分属于拟南芥G、A、I和C四个bZIP家族，将其分别命名为Tc-AtbZIP55-like、Tc-AtbZIP36-like、TcbZIP-C8和TcbZIP-I11TcbZIP1。其中Tc-AtbZIP55-like能与紫杉醇合成相关基因ts基因启动子结合，ts基因启动子上具有G-box，证明了Tc-AtbZIP55-like是GBF类转录因子。
　　2) SA处理红豆杉细胞后，在不同时间点检测细胞内Tc-AtbZIP55-like表达情况，发现该基因受到SA诱导处理，在1h表达量呈最高。而超表达Tc-AtbZIP55-like红豆杉细胞系中ts基因表达没有明显著增加。
　　3)从中国红豆杉细胞中克隆得到了TcNPR1基因，该基因含有典型的NPR1保守结构域、锌指结构域和锚蛋白结构域。TcNPR1基因表达响应 SA，30％PEG6000和200 mM NaCl胁迫处理，基因表达量随着处理时间增加而逐渐增加。而超表达TcNPR1红豆杉细胞系中ts基因表达量没有明显增加。
　　4)叶盘法转化烟草叶片，获得两株阳性TcNPR1烟草植株Tr1和Tr21。Tr1和转基因烟草的抗逆性增强，叶片内可溶性糖含量增加2倍左右，说明TcNPR1基因参与了植物的抗逆反应。

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1 绪 论

1.1 植物响应SA信号途径

1.2 bZIP转录因子研究进展

1.3 NPR1基因研究进展

1.4 本研究的主要内容和目的

2 中国红豆杉细胞bZIP转录因子克隆与特征分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

3 中国红豆杉细胞Tc-AtbZIP55-like转录因子的功能研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

4 中国红豆杉细胞TcNPR1克隆与功能研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

5 全文总结与展望

5.1 本文总结

5.2 展 望

致谢

参考文献

附录I 攻读硕士期间发表论文情况

附录II 主要缩略词