慢性鼻-鼻窦炎中TFH细胞的表达及其与B细胞相关性的研究

摘要

研究背景:
　　慢性鼻-鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS)表现为鼻腔和鼻窦黏膜持续的慢性炎症，其在美国的发病率约14％，在我国也呈逐年上升趋势。CRS根据是否伴发鼻息肉(nasal polyps)分为伴NP的CRS(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)和不伴NP的CRS(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSsNP)。CRSwNP又根据局部组织嗜酸粒细胞浸润的情况分为嗜酸粒细胞性CRSwNP(eosinophilic CRSwNP,Eos CRSwNP)和非嗜酸粒细胞性CRSwNP(Non-Eos CRSwNP)。越来越多的证据表明Eos CRSwNP和Non-Eos CRSwNP在许多方面均具有异质性。
　　目的:
　　研究导致Eos CRSwNP中嗜酸粒细胞增高的使动因素和与之相关的分子事件，可能为阐明CRS的发病机制增加新内容，为CRS的治疗提供新的途径。
　　具体研究目标如下：
　　(1)证明鼻黏膜组织中异位淋巴滤泡样结构的存在及可能存在的功能；
　　(2)检测鼻黏膜中免疫球蛋白的亚型；
　　(3)检测TFH细胞和B细胞相关基因在正常下鼻甲黏膜，病变筛窦黏膜，Eos CRSwNP和Non-Eos CRSwNP的NP组织中的表达水平；
　　(4)检测不同类型TFH细胞和B细胞在不同表型CRS的表达情况；
　　(5)分析TFH细胞在鼻黏膜的定位；
　　(6)分析TFH细胞和B细胞的相关性及TFH细胞和鼻黏膜局部免疫球蛋白的相关性。
　　研究方法:
　　(1)免疫组织化学和免疫荧光技术检测鼻黏膜中异位淋巴滤泡样结构的存在；
　　(2)Multiplex法验证鼻黏膜组织免疫球蛋白的表达；
　　(3)实时定量RT-PCR检测正常下鼻甲黏膜，炎症的筛窦黏膜，Eos CRSwNP和Non Eos CRSwNP的NP组织中TFH细胞相关基因：Bcl-6(核转录因子)，C-maf(转录因子)，BATF(转录因子)，CXCR5(趋化因子受体)，Blimp(核转录因子Bcl-6的抑制因子)，BTLA(表面标记，抑制性共受体)，ICOS(正向表面标记)，PD-1(负向表面标记)，IL-21(功能分子)，IL-21R，NRP1(TFH细胞活化标记)的表达；B细胞相关基因(PAX5、BAFF、April，CXCL13，CXCL12)的表达及TFH细胞和B细胞相互作用的共刺激分子(CD40和CD40L)的表达；
　　(4)流式细胞仪技术(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)检测正常下鼻甲黏膜，Eos CRSwNP和Non Eos CRSwNP的NP组织和外周血单个核细胞中CD4+CXCR5+TFH细胞、CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞、CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞、CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH细胞的百分比和TFH细胞分泌IL-21，IL-17A，IFNγ，IL-4的情况及IL-21+CD4+CXCR5+TFH细胞,IL-4+CD4+CXCR5+TFH细胞,IL-17A+CD4+CXCR5+TFH细胞,IFNγ+CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比；
　　(5)FACS检测正常下鼻甲黏膜，Eos CRSwNP和Non Eos CRSwNP的NP组织和外周血中CD3-CD19+BC(总BC)，CD3-CD19+IgD+CD38-BC(静息nave BC)，CD3-CD19+IgD+CD38+BC(活化nave BC)，CD3-CD19+IgD+BC(总nave BC)，CD3-CD19+IgD-CD38-BC(记忆性BC)，CD3-CD19+IgD+CD38-BC(生发中心BC)，CD3-CD138+PC(浆细胞)的百分比；
　　(6)免疫荧光技术检测CD4+CXCR5+TFH细胞和/或CD4+BCL6+TFH细胞在鼻黏膜的表达部位；
　　实验结果:
　　(1)免疫组织化学和免疫荧光组织化学表明鼻黏膜组织中存在异位淋巴滤泡样结构，息肉组织中淋巴滤泡样结构较下鼻甲黏膜中淋巴滤泡样结构显著增多；淋巴滤泡样结构表现为以CD20+BC和CD138+浆细胞浸润为主，其中该滤泡样结构还高表达抗体类别转化重组的关键酶AID；
　　(2)Mutiplex检测结果示鼻黏膜匀浆上清中IgG1，IgG2，total IgG在Eos CRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组的表达较正常对照组上升，但未达统计学差异；IgM和IgG3的表达在各组间表达相当，无明显趋势；而IgA在Eos CRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组的表达较正常对照组上升，具有统计学差异；IgE在Eos CRSwNP中的表达较Non-Eos CRSwNP和正常对照组表达升高，有统计学差异；IgG4的表达在Eos CRSwNP中表达较正常对照组表达上调，其余各组间均无统计学差异；
　　(3)实时定量RT-PCR显示TFH细胞的核转录因子BCL-6在CRSsNP组(P=0.004)、Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.001)中表达较正常对照组显著升高，Non-Eos CRSwNP组中BCL-6的表达较CRSsNP组显著增高(P=0.028)，其余各组间无统计学差异；TFH细胞的核转录因子C-maf在CRSsNP组(P=0.000)、Eos CRSwNP组(P=0.002)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.001)中表达较正常对照组显著升高，其余各组间无统计学差异；TFH细胞的核转录因子BATF的表达在各组间无明显统计学差异；BCL-6(TFH细胞关键的核转录因子)的拮抗分子Blimp1的表达在Eos CRSwNP组(P=0.012)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.000)中表达较正常对照组显著升高，CRSsNP组中Blimp1的表达较正常对照组升高，但未达到统计学差异(P=0.056)，Non-Eos CRSwNP组中Blimp1的表达较CRSsNP组升高，但未达到统计学差异(P=0.051)；TFH细胞的活化标记NRP1在正常下鼻甲组的表达较CRSsNP组(P=0.014)、Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.002)显著下调，CRSsNP组中NRP1的表达较Eos CRSwNP组显著下调(P=0.007)，余各组间无统计学差异；TFH细胞的表面标记：趋化因子受体CXCR5的表达在CRSsNP组(P=0.008)、Eos CRSwNP组(P=0.004)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.013)较正常对照组织显著上调；Eos CRSwNP组中BTLA的表达较正常对照组显著升高(P=0.004)，余各组间无统计学差异；ICOS的表达在Eos CRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组中的表达较CRSsNP组和正常对照组上调，但未达统计学差异；CD40L在正常下鼻甲组的表达较CRSsNP组(P=0.048)、Eos CRSwNP组(P=0.001)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.002)显著下调；TFH细胞的重要因子IL-21的表达在EosCRSwNP组的表达较正常对照组(P=0.002)、CRSsNP组(P=0.013)、和Non-Eos CRSwNP组(P=0.011)显著上调；IL-21R在CRSsNP组(P=0.025)、Eos CRSwNP组(P=0.004)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.004)中表达较正常对照组显著升高；
　　(4)鼻黏膜组织局部FACS检测的结果显示CD4+CXCR5+TFH细胞占鼻黏膜单个核细胞(nasal mononuclear cells,NMC)的百分比在EosCRSwNP组(P=0.005)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.002)较正常对照组显著上调；CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组(P=0.006)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.002)较正常对照组显著上调；CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在EosCRSwNP组(P=0.001)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.033)较正常对照组显著上调；CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在各组间无统计学差异，而CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组(P=0.015)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.004)较正常对照组显著增高；CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在EosCRSwNP组较Non-Eos CRSwNP组和正常对照组显著升高；CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH细胞占NMC的频数在EosCRSwNP组(P=0.006)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.011)较正常对照组显著上升，具有统计学意义；另外，CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞/CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞的值在EosCRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组较正常对照组显著上升，具有统计学意义；
　　(5)外周血FACS检测的结果显示CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞占外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的百分比在EosCRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组较正常对照组显著上调；CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在EosCRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组较正常对照组显著上调；CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞/CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞的值在EosCRSwNP组较正常对照组显著上升，具有统计学意义，Non-Eos CRSwNP组中CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞/CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞的值较正常对照组升高，但无统计学意义；CD4+CXCR5+TFH细胞占PBMC的百分比，CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞占PBMC的百分比，CD4+CXCR5+PD1+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比，CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH细胞占PBMC的百分比，CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在各组间均无统计学差异；
　　(6)鼻黏膜组织局部FACS检测的结果显示IL-21+细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组较正常对照组升高；CD4+CXCR5+IL-21+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在EosCRSwNP和Non-EosCRSwNP组的百分率较正常对照组上升趋势，未达统计学意义；CD4+CXCR5+IL-21+TFH细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组较正常对照组显著上调，EosCRSwNP组较Non-Eos CRSwNP组中CD4+CXCR5+IL-21+TFH细胞占NMC的百分比显著上调；IL-4+细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组较Non-Eos CRSwNP组和正常对照组显著升高；CD4+CXCR5+IL-4+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在EosCRSwNP组较正常对照组和Non-Eos CRSwNP组显著上调，Non-Eos CRSwNP组中CD4+CXCR5+IL-4+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比较正常对照组显著上调；CD4+CXCR5+IL-4+TFH细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组较正常对照组和Non-Eos CRSwNP组显著上调，Non-Eos CRSwNP组中CD4+CXCR5+IL-4+TFH细胞占NMC的百分比较正常对照组显著上调；IFNγ+细胞占NMC的百分比在Non-EosCRSwNP组和Eos CRSwNP组较正常对照组显著升高；CD4+CXCR5+IFNγ+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在Non-EosCRSwNP和Eos CRSwNP组较正常对照组显著上调，CD4+CXCR5+IFNγ+TFH细胞占NMC的百分比在Non-EosCRSwNP组和Eos CRSwNP组较正常对照组显著上升；IL-17A+细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组和Non-EosCRSwNP组较正常对照组显著升高；CD4+CXCR5+IL-17A+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比在EosCRSwNP组和Non-EosCRSwNP组较正常对照组显著升高；CD4+CXCR5+IL-17A+TFH细胞占NMC的百分比在EosCRSwNP组和Non-EosCRSwNP组较正常对照组显著升高；
　　(7)外周血FACS检测的结果显示IL-21+细胞，IL-4+细胞，IFNγ+细胞，IL-17A+细胞占 PBMC的百分比在各组间均无统计学差异；CD4+CXCR5+IL-21+TFH细胞，CD4+CXCR5+IL-4+TFH细胞，CD4+CXCR5+IL-17A+TFH细胞，CD4+CXCR5+IFNγ+TFH细胞占 PBMC的百分比于各组间均无统计学差异；CD4+CXCR5+IL-21+TFH细胞，CD4+CXCR5+IL-4+TFH细胞，CD4+CXCR5+IL-17A+TFH细胞，CD4+CXCR5+IFNγ+TFH细胞占CD4+CXCR5+TFH细胞的百分比于各组间未见统计学差异；
　　(8)FACS检测的结果示鼻黏膜组织局部存在CD3-CD19+B细胞、CD3-CD19+IgD-CD38-B细胞(记忆B细胞)、CD3-CD19+IgD+CD38-B细胞(静息的nave B细胞)、CD3-CD19+IgD+CD38+B细胞(活化的nave B细胞)、CD3-CD19+IgD+B细胞(total nave B细胞)、CD3-CD19+IgD-CD38+B细胞(生发中心B细胞)。鼻黏膜组织中CD3-CD19+BC/NMC的百分比在Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.001)中较正常对照组显著上调；CD3-CD19+IgD+CD38-B细胞/NMC的百分比在EosCRSwNP组(P=0.011)较正常对照组显著上调；CD3-CD19+IgD+CD38+B细胞/NMC的百分比在Eos CRSwNP组和 Non-Eos CRSwNP组较正常对照组，表达上调，但无统计学差异；CD3-CD19+IgD+B细胞占NMC的百分比在Eos CRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组较正常对照组表达上调，但无统计学差异；CD3-CD19+IgD-CD38-B细胞/NMC的百分比在Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.003)中较正常对照组显著上调；CD3-CD19+IgD-CD38+B细胞/NMC的频数在Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.001)中较正常对照组显著升高；CD3-CD19+IgD+CD38-B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在正常对照组较EosCRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组表达上调，但未达统计学差异；CD3-CD19+IgD+CD38+B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在正常对照组较Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.000)较正常对照组表达上调；CD3-CD19+IgD+B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在正常对照组较Eos CRSwNP组(P=0.003)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.007)表达上调；CD3-CD19+IgD-CD38-B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在Eos CRSwNP组(P=0.000)较正常对照组显著上调；CD3-CD19+IgD-CD38+B细胞/CD3-CD19+B细胞的频数在Eos CRSwNP组和Non-Eos CRSwNP组中较正常对照组升高，但未达统计学差异。
　　(9)流式细胞学检测患者外周血中同样存在CD3-CD19+B细胞、CD3-CD19+IgD-CD38-B细胞、CD3-CD19+IgD+CD38-B细胞、CD3-CD19+IgD+CD38+B细胞、CD3-CD19+IgD+B细胞、CD3-CD19+IgD-CD38+B细胞、CD3-CD19+IgD-CD38+++浆细胞。CD3-CD19+IgD+CD38-B细胞/PBMC的百分比在EosCRSwNP组较正常对照组显著上调(P=0.029)；CD3-CD19+B细胞/PBMC，CD3-CD19+IgD-CD38-B细胞/PBMC，CD3-CD19+IgD+CD38+B细胞/PBMC，CD3-CD19+IgD+B细胞/PBMC，CD3-CD19+IgD-CD38+B细胞/PBMC的百分比在各组间均无统计学差异；CD3-CD19+IgD+CD38-B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在正常对照组较Eos CRSwNP组(P=0.007)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.027)表达下调；CD3-CD19+IgD+CD38+B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在Eos CRSwNP组(P=0.002)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.008)较正常对照组下调；CD3-CD19+IgD+B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在正常对照组较Eos CRSwNP组(P=0.003)表达上调；CD3-CD19+IgD-CD38-B细胞/CD3-CD19+B细胞的百分比在Eos CRSwNP组(P=0.012)较正常对照组显著上调；其余各组间未见统计学差异。
　　(10)流式细胞学检测的结果显示鼻黏膜组织局部存在CD3-CD138+浆细胞。鼻黏膜组织中CD3-CD138+浆细胞/NMC的百分比在Eos CRSwNP组(P=0.000)和Non-Eos CRSwNP组(P=0.000)中较正常对照组显著上调。
　　(11)免疫荧光显示鼻黏膜局部有CD4+CXCR5+TFH细胞和CD4+BCL6+TFH细胞的表达，滤泡样结构周围表达较多，鼻黏膜间质也有少量表达；
　　(12)鼻黏膜中CD4+CXCR5+TFH/NMC(％)与CD3-CD19+BC/NMC(％)具有正相关(R=0.857，P=0.000)；与CD3-CD19+IgD+CD38-BC/BC(％)无明显相关性(R=-0.242，P=0.181)；与CD3-CD19+IgD+CD38+BC/BC(％)呈负相关(R=-0.735，P=0.000)；与CD3-CD19+IgD+BC/BC(％)呈负相关(R=-0.517，P=0.002)；与CD3-CD19+IgD-CD38-BC/BC(％)呈正相关(R=0.490，P=0.004)；与CD3-CD19+IgD-CD38+BC/BC(％)呈正相关(R=0.466，P=0.007)；与CD3-CD138+IgD+CD38+PC/NMC(％)呈正相关(R=0.439，P=0.012)；
　　鼻黏膜局部IgE的水平与CD4+CXCR5+ICOS+TFH/TFH(％)呈正相关(R=0.512，P=0.001)；与CD4+CXCR5+PD1+TFH/TFH(％)无明显相关性(R=-0.181，P=0.283)；与CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH/TFH(％)呈正相关(R=0.548，P=0.000)；与CD4+CXCR5+TFH/NMC(％)无明显相关性(R=0.070，P=0.680)；与CD4+CXCR5+ICOS+TFH/NMC(％)无明显相关性(R=0.289，P=0.083)；与CD4+CXCR5+PD1+TFH/NMC(％)无明显相关性(R=0.097，P=0.580)；与CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH/NMC(％)呈正相关(R=0.350，P=0.034)；
　　鼻黏膜局部IgA的水平与CD4+CXCR5+ICOS+TFH/TFH(％)呈正相关(R=0.706，P=0.000)；与CD4+CXCR5+PD1+TFH/TFH(％)无明显相关性(R=-0.201，P=0.233)；与CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH/TFH(％)呈正相关(R=0.506，P=0.001)；与CD4+CXCR5+TFH/NMC(％)呈正相关(R=0.332，P=0.045)；与CD4+CXCR5+ICOS+TFH/NMC(％)呈正相关(R=0.566，P=0.000)；与CD4+CXCR5+PD1+TFH/NMC(％)无明显相关性(R=0.314，P=0.066)；与CD4+CXCR5+ICOS+PD1+TFH/NMC(％)呈正相关(R=0.539，P=0.001)。
　　结论:
　　(1)本研究发现鼻黏膜组织中存在一定数量的以CD20和CD138细胞聚集为特点的异位淋巴滤泡样组织，这类淋巴滤泡样结构可能具有一定的功能，但是和传统的淋巴组织中的淋巴滤泡的特点和功能可能不完全相同；
　　(2)本研究证明了TFH细胞相关基因和其亚型在EosCRSwNP组和Non-EosCRSwNP组表达升高，TFH细胞及其亚型在EosCRSwNP组和Non-EosCRSwNP组表达亢进，可能导致不同亚型的免疫球蛋白的产生增多，进而表现为鼻黏膜组织不同的病理表型；
　　(3)本研究首次证明了鼻黏膜中表达不同B细胞亚型，TFH细胞可能辅助特定亚型的B细胞产生抗体，导致CRS的发病；
　　(4)本课题首次在CRS中研究了TFH细胞的定位和表达，TFH细胞可能参与了CRS的发病机制，这为CRS的治疗和研究提了供新的途径，带来了曙光。

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英文缩略语对照表

中文摘要

英文摘要

研究背景和课题思路

参考文献

第一部分 鼻黏膜中的淋巴滤泡样结构的研究

前沿

材料与方法

统计学方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 TFH细胞与B细胞相关性的研究

前沿

材料与方法

统计学处理

结果

讨论

参考文献

全文小结

第三部分 综述

参考文献

攻读博士学位期间已发表论文

致谢