组织因子靶向性纳米粒介导siRNA靶向递送的研究

摘要

组织因子（TF）作为凝血途径的始动因子以为人所熟知。在血管损伤后，TF和凝血因子VIIa（FVIIa）形成复合物激活凝血蛋白酶的瀑布反应，导致纤维蛋白沉积和血小板的活化。另外，在许多疾病如败血症，动脉粥样硬化和肿瘤，血管中TF的异常表达会引起致命的血栓形成。近年来研究表明，血管中的TF在产生凝血蛋白酶和后续激活蛋白酶激活受体(PARS)中也发挥着非止血作用。这些TF依赖性的信号通路促进了一系列生物进程，包括炎症，肿瘤转移和细胞迁移。本课题组前期研究的EGFP-EGF1蛋白具有TF特异性和高度的亲和力，且将其连接于聚乙二醇-聚乳酸-聚羟基乙酸纳米粒（PLGA）纳米粒表面后构建的EGFP-EGF1-PLGA纳米粒也具有TF靶向性。
　　小干扰RNAs（siRNA）通过完全互补的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导特异性切割，并有针对性的破坏靶基因的mRNA，从而产生靶基因的mRNA序列特异基因沉默效应。它们已被证明能有效下调人类细胞中的基因表达，从而具有治疗疾病的潜力。然而，siRNA分子本身带负电荷，易于被血清中的核酸酶降解，容易被肾脏清除，并无靶向分布能力，这些都导致它难以到达作用的靶细胞。它的应用受到如稳定性差，半衰期短，和沉默效率低等许多限制。因此，siRNA作为RNA干扰（RNAi）的一种手段，其治疗最为主要的障碍是缺乏有效的递送系统。病毒递送系统如慢病毒、腺病毒，可有较高的转染效率，但由于其致突变性，载药量有限，以及引起炎症反应和免疫应答等安全隐患而受到限制。因此，直接的系统性的非病毒载体是siRNA的最佳选择，该载体应具有运载核酸类分子如基因，siRNAs，或反义RNA等进入细胞的能力。非病毒递送系统包括siRNA的化学修饰，脂质体，纳米粒，多肽和靶向递送。随着合成材料和纳米技术的发展，可以合成具有特殊功能的纳米材料。其在生物学领域的应用变得普遍。纳米材料因其具有低毒性，良好的生物降解性和生物相容性，而被用作转染载体，如壳聚糖，聚乙烯亚胺（PEI），聚乳酸-聚羟基乙酸（PLGA），磁性纳米粒和纳米碳管等。因为可以抵抗高核酸酶并具有粘膜粘附特性，使得它们成为siRNA重要的载体。靶向 RNAi治疗是一个相对新的研究领域，它可以满足体内递送要求的选择靶向性。靶向病变细胞，器官或组织可以提高一定siRNA剂量下的基因沉默效率。特异性的细胞靶向功能还可以抑制siRNA对非病变细胞造成的副作用。通过具有高度特异性和亲和力的抗体，短肽和其他配体连接于载体表面可以介导siRNA到达靶向组织和细胞。
　　前期研究采用复乳法制备的EGFP-EGF1-PLGA纳米粒，适合包载水溶性的基因药物。它不仅对包载的药物具有保护作用，还可将其靶向递送至病变组织或细胞。鉴于上述基础，本研究将利用该纳米粒作siRNA或shRNA的载体，靶向递送至病变细胞，发挥基因沉默效应。由于前期的研究都是基于大鼠模型的疾病进行，而有些疾病模型在小鼠中更为经典，为了拓宽该纳米粒的应用范围，本研究还验证了ENP在小鼠高表达TF的疾病模型（动脉粥样硬化模型）中的靶向性。
　　第一部分 载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒的构建及表征
　　目的:筛选出有效的大鼠组织因子特异性的siRNA片段(TF-siRNA)；将该片段载入EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒（PEG-PLGA）中，并对该纳米粒的性质进行鉴定。
　　方法:选择大鼠胶质瘤细胞系C6来筛选siRNA片段，细胞表面天然表达TF，通过传统转染试剂lipo2000转染细胞，进行实时定量PCR（Q-PCR）和western-blot检测细胞组织因子的mRNA和蛋白水平改变，进而筛选出最佳的TF-siRNA片段。
　　采用复乳法，合成出包载TF-siRNA的PLGA纳米粒（TF-siRNA-NP），之后将EGFP-EGF1蛋白巯基化，连接于TF-siRNA-NP表面，合成出TF-siRNA-ENP。通过粒径/Zeta电位测定仪对纳米粒的粒径和 Zeta电位进行测定。通过普通电镜观察纳米粒的形态，并通过免疫电镜观察纳米粒表面连接的蛋白。提取纳米粒中的siRNA计算siRNA的载药量和包封率。通过体外释放实验计算出siRNA的释放量。
　　结果:siRNA-638片段为大鼠组织因子最佳沉默片段。载入TF-siRNA的ENP（TF-siRNA-ENP）粒径大小约100nm左右，外观大小均一、圆整。Zeta电位为-11mV左右。免疫电镜结果证实纳米粒表面连接有EGFP-EGF1蛋白。TF-siRNA的包封率约81.33％。体外不同pH环境中siRNA的释放无明显差异，6小时内快速释放约42％。
　　结论:TF-siRNA-ENP粒径大小，EGFP-EGF1蛋白的成功连接，siRNA的载药量和体外的快速释放都可满足后续实验需求。
　　第二部分 载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒的靶向性及体外评价
　　目的:验证TF-siRNA-ENP对损伤的脑微血管内皮细胞（BMECs）的靶向性。评价TF-siRNA-ENP对肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导的BMECs损伤过程中，组织因子表达和组织因子活性的抑制效果。评价该纳米粒的细胞毒性。
　　方法:两次消化加Percoll梯度离心法提取大鼠BMECs，TNFα诱导BMECs的损伤，建立损伤的微血管内皮细胞模型。在ENP纳米粒表面连接香豆素-6示踪纳米粒，测定其载药量等性质，并进行细胞摄取实验；同时用对siRNA进行标记，在BMECs中示踪siRNA。转染TF-siRNA-ENP进入诱导的BMECs，通过实时定量PCR，western-blot，和流式检测TF表达水平的改变。并通过TF活性检测评价其对细胞TF活性的影响。CCK-8法检测纳米粒的细胞毒性。
　　结果:TNFα诱导损伤的BMECs可以高表达TF。TF-siRNA-ENP可以更好的被损伤BMECs摄取，介导siRNA进入细胞内。有效下调损伤过程中细胞TF mRNA和蛋白的表达水平。并能有效降低细胞TF的活性。在有效作用剂量下TF-siRNA-ENP对细胞活性无影响，较lipo2000明显优势。
　　结论:TF-siRNA-ENP是TF-siRNA靶向递送至损伤内皮细胞的一个有效递送系统。它的细胞安全性好，基因沉默效率高。
　　第三部分 EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒在动脉粥样硬化模型中靶向性的研究
　　目的:验证EGFP-EGF1-PLGA纳米粒（ENP）对小鼠动脉粥样硬化模型（AS模型）的靶向性。
　　方法:通过复乳法，分别构建载香豆素-6和Dir的ENP纳米粒。分别测定他们的载药量。用单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)诱导原代小鼠主动脉平滑肌细胞（VSMCs），用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导小鼠单核巨噬细胞（Raw264.7）分别构建体外高表达TF的动脉粥样硬化细胞模型。高脂伺料持续14周喂养ApoE基因敲除小鼠（ApoE-/-），建立小鼠动脉粥样硬化模型。细胞摄取载香豆素-6纳米粒的实验，通过荧光显微镜和流式细胞学检测细胞内的荧光强度，判断其细胞靶向性。通过油红O染色和血清胆固醇脂的测定来验证AS动物模型中粥样硬化斑块的形成。载Dir的纳米粒进行器官成像实验，观察其体内分布；同时进行冰冻切片，激光共聚焦直接观察纳米粒在病变血管中的分布。
　　结果:两种细胞经过诱导后建立的细胞模型，均可高表达TF。ENP纳米粒可以更好的被模型细胞所摄取。与不连接EGFP-EGF1蛋白的纳米粒之间的差异具有统计学意义。高脂饮食喂养14周的ApoE-/-小鼠血清胆固醇脂明显升高，主动脉血管切片中可见内膜增厚和脂质斑块的沉积。器官成像结果显示AS模型中，斑块区域可更好的摄取ENP纳米粒。切片结果显示ENP在血管中多分布在高表达TF的部位，并可以部分与斑块区域重合。
　　结论:ENP具有小鼠AS模型的靶向性。
　　第四部分 载CCR2-shRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒的体外研究
　　目的:在体外验证载CC趋化因子2特异性shRNA（CCR2-shRNA）的ENP（CCR2-shRNA-ENP）可以有效下调AS细胞模型的CCR2表达，并抑制细胞的迁移能力。
　　方法:通过双重免疫荧光法和实时定量PCR检测AS模型小鼠主动脉内CCR2和TF的表达情况。通过实时定量PCR，选择诱导剂MCP-1和oxLDL最佳的作用浓度及作用时间点，构建体外同时高表达TF和CCR2的AS细胞模型。诱导后的细胞给予CCR2-shRNA-ENP干预，通过实时定量PCR和western-blot测定细胞CCR2表达水平的改变。同时用CCK-8法评价CCR2-shRNA-ENP的细胞毒性。转染CCR2-shRNA-ENP的细胞，分别进行细胞迁移实验，评价其对这两种细胞迁移能力的改变。
　　结果:AS模型小鼠主动脉内高表达TF和CCR2，在14周时两者表达都处于高位。通过Q-PCR结果选择MCP-1以10ng/ml作用于VSMCs2h，oxLDL以50μg/ml作用于Raw264.71h，来构建细胞模型。转染CCR2-shRNA-ENP后的模型细胞CCR2表达在mRNA和蛋白水平都有明显下降。且不影响细胞活性。同时，细胞的迁移能力也有明显降低。
　　结论:CCR2-shRNA-ENP可以作为有效的CCR2-shRNA靶向运载系统。运载CCR2-shRNA到AS细胞模型中，发挥基因沉默效应，并有效抑制模型细胞的迁移。为后续的动物实验打下基础。

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前言

第一部分 载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒的构建及表征

1. 仪器及材料

2. 实验方法

3．实验结果

4. 讨论

第二部分 载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒的靶向性及体外评价

1 仪器和材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒在动脉粥样硬化模型中靶向性的研究

1 仪器和材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四部分 载CCR2-shRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇－聚乳酸－聚羟基乙酸纳米粒的体外研究

1 仪器和材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

全文总结

综述 siRNAs 在体内的非病毒靶向递送

参考文献

英文缩写对照

致谢

附录一 攻读博士学位期间发表的学术论文

附录二 攻读博士学位期间参与课题和会议报告