Pten/Akt与线粒体信号通路在BPA诱导大鼠睾丸组织细胞凋亡中的作用

摘要

本文主要从以下几个方面展开论述:
　　第一部分 BPA对大鼠睾丸支持细胞的影响及其机制研究
　　目的：双酚A（Bisphenol A, BPA）是一种在外环境中广泛存在的环境内分泌干扰物，可对雄性生殖系统产生影响，但其生殖毒性的机制研究还十分有限，本文旨在探讨BPA暴露对大鼠睾丸支持细胞的影响及其机制的研究。
　　方法：采用不同终浓度的BPA（0、30、50及70mol/L）处理离体培养的支持细胞。采用MTT法测定细胞活力；酶标仪检测支持细胞内ROS的含量；采用SOD和MDA试剂盒检测细胞总SOD活力及MDA含量；采用实时荧光定量PCR检测支持细胞中Pten、Pdk1、Akt、cytochrome c、 Bax及procaspase-8的mRNA表达水平；采用Western blotting方法测定支持细胞中Pten、phospho-Akt、cytochrome c、Bax、Bcl-2蛋白表达水平以及凋亡相关蛋白procaspase-9和cleaved caspase-3的表达水平；采用流式细胞术检测支持细胞凋亡率，采用 AO/EB及Hoechst33258检测支持细胞凋亡的形态学改变。
　　结果：50mol/L的BPA致支持细胞活力明显下降(P<0.05)；与对照组相比，BPA暴露还可以显著增加细胞内ROS的含量及支持细胞MDA的含量，显著降低支持细胞 SOD活力(P<0.05)；不过，NAC的预处理则可显著降低胞内ROS的含量(P<0.05)。
　　BPA暴露可诱导大鼠睾丸支持细胞Pten、Pdk1、Akt mRNA、cytochrome c、Bax以及procaspase-8mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。但NAC预处理可以拮抗BPA诱导的Bax、procaspase-8及cytochrome c mRNA水平的改变(P<0.05)。
　　BPA暴露还可导致支持细胞Pten、cytochrome c、Bax的蛋白水平增加，而Phospho-Akt及Bcl-2蛋白水平下降(P<0.05)；凋亡相关蛋白procaspase-9表达水平明显下降，而cleaved caspase-3蛋白表达水平则显著增高(P<0.05)。NAC预处理可以逆转cytochrome c、Bax表达水平，但对Bcl-2水平的改变不明显。
　　流式细胞术检测结果表明BPA暴露可诱导支持细胞凋亡(P<0.05)。Hoechst及AO/EB双染色结果也表明BPA可引起支持细胞核固缩，DNA断裂等凋亡形态学改变。但是，抗氧化剂NAC可以明显拮抗BPA引起的细胞凋亡(P<0.05)。
　　结论：BPA暴露导致支持细胞的活力下降及细胞内氧化应激水平升高并诱导支持细胞凋亡，Pten/Akt信号通路在BPA诱导细胞凋亡中发挥重要作用，而ROS可以通过介导线粒体信号通路诱导细胞凋亡。
　　第二部分 BPA对青春前期SD大鼠睾丸细胞的影响及其机制研究
　　目的：旨在体外研究基础上探讨BPA对青春前期SD大鼠睾丸细胞的影响及其机制研究。
　　方法：对青春前期SD大鼠按1ml/kg剂量，采用腹腔注射的方式进行BPA染毒，分组如下：溶剂对照组、2 mg/kg b.wt、10 mg/kg b.wt及50 mg/kg b.wt。染毒方式为隔天染毒，共10天，染毒结束后第二天处死动物。用westernblotting方法检测睾丸组织中Pten、Phospho-Akt、Bax、cytochrome c、FasL及凋亡相关蛋白procaspase-3及cleaved caspase-3蛋白水平；用TUNEL法检测睾丸组织凋亡状况；HE染色观察大鼠睾丸组织病理结构的改变。
　　结果：与对照组相比，BPA的作用可导致睾丸组织中Pten、Bax、cytochrome c、FasL的蛋白表达量增加，凋亡相关蛋白cleaved caspase-3蛋白表达水平升高，而procaspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。不过，BPA暴露对Phospho-Akt蛋白表达水平无明显影响；TUNEL检测结果表明，BPA暴露可诱导睾丸生殖细胞凋亡(P<0.05)；HE染色结果则显示，10、50 mg/kg b.wt剂量可致睾丸组织生殖细胞层数及数目均下降。
　　结论：BPA染毒对青春前期大鼠睾丸组织细胞凋亡；BPA可以通过线粒体途径诱导生殖细胞凋亡；BPA还可以上调Pten蛋白表达量，但其诱导生殖细胞凋亡过程中具体机制还有待进一步探讨；BPA还可能通过激活FasL途径诱导生殖细胞凋亡。

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前言

第一部分 BPA对大鼠睾丸支持细胞的影响及其机制研究

1、实验材料和方法

2、结果

3、讨论

4、小结

第二部分、BPA对青春前期SD大鼠睾丸细胞的影响及其机制研究

1、材料和方法

2、结果

3、讨论

4、小结

总结

本研究创新之处

参考文献

综述

附录

致谢