Akt/mTOR与线粒体信号通路在BPA诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用

摘要

BPA(Bisphenol A)是一种重要的工业原料，主要用于生产聚碳酸酯塑料（polycarbonate plastic，PC）以及环氧树脂（epoxy resin），BPA每年的产量超过270万吨，根据预测，其需求量还会以每年6~10％的速度增长。由于BPA的大量产出，以及聚碳酸酯塑料和环氧树脂的广泛使用，加之BPA易于逸散与迁移，因而导致BPA在环境中广泛存在。鉴于以上原因，虽然BPA在环境介质与生物体中的半衰期较短，但 BPA的暴露风险仍持续存在，许多研究者已经在各种人群样本中检测出不同浓度的BPA。
　　BPA是一种典型的内分泌干扰物，具有弱的雌激素活性以及较强的抗雄激素活性。此外，BPA能导致生物体内氧化应激。实验室研究和人群流行病学调查都表明 BPA暴露与男性生殖障碍具有相关性。尽管一部分研究持相反论点，然而由于精子发生是一个精密复杂的过程，有赖于稳定的微环境与多方面的准确调控，任何外部干扰都有可能打破这种平衡状态，因此BPA的危害不容忽视。
　　Akt/mTOR信号通路是生物体中重要的调控通路，其调控机能涉及细胞生存、分化、增值、代谢、以及迁移，近年来，该通路在生殖系统中的重要性，尤其是精子发生过程中的重要作用逐步被认识到，有研究表明当该通路受到抑制时，生精过程受到干扰。正常的精子发生过程中细胞凋亡的作用必不可少，它是清除过量或异常生精细胞的一种重要途径，其中，线粒体凋亡通路的作用已被证实，然而，过度的凋亡必然影响到正常的精子发生过程。
　　考虑到 BPA能诱导生殖系统内氧化应激，进而可能激活线粒体凋亡通路，BPA(Bisphenol A)是一种重要的工业原料，主要用于生产聚碳酸酯塑料（polycarbonate plastic，PC）以及环氧树脂（epoxy resin），BPA每年的产量超过270万吨，根据预测，其需求量还会以每年6~10%的速度增长。由于BPA的大量产出，以及聚碳酸酯塑料和环氧树脂的广泛使用，加之BPA易于逸散与迁移，因而导致BPA在环境中广泛存在。鉴于以上原因，虽然BPA在环境介质与生物体中的半衰期较短，但 BPA的暴露风险仍持续存在，许多研究者已经在各种人群样本中检测出不同浓度的BPA。
　　BPA是一种典型的内分泌干扰物，具有弱的雌激素活性以及较强的抗雄激素活性。此外，BPA能导致生物体内氧化应激。实验室研究和人群流行病学调查都表明 BPA暴露与男性生殖障碍具有相关性。尽管一部分研究持相反论点，然而由于精子发生是一个精密复杂的过程，有赖于稳定的微环境与多方面的准确调控，任何外部干扰都有可能打破这种平衡状态，因此BPA的危害不容忽视。
　　Akt/mTOR信号通路是生物体中重要的调控通路，其调控机能涉及细胞生存、分化、增值、代谢、以及迁移，近年来，该通路在生殖系统中的重要性，尤其是精子发生过程中的重要作用逐步被认识到，有研究表明当该通路受到抑制时，生精过程受到干扰。正常的精子发生过程中细胞凋亡的作用必不可少，它是清除过量或异常生精细胞的一种重要途径，其中，线粒体凋亡通路的作用已被证实，然而，过度的凋亡必然影响到正常的精子发生过程。
　　考虑到 BPA能诱导生殖系统内氧化应激，进而可能激活线粒体凋亡通路，又由于 Akt/mTOR信号通路与线粒体凋亡通路具有极为密切的联系，本研究以BPA引起雄性生殖系统内氧化应激为切入点，以不同年龄段的雄性SD大鼠为研究对象，应用生物化学及分子生物学的技术与方法来研究Akt/mTOR与线粒体信号通路在BPA诱导大鼠生殖毒性中的作用。
　　第一部分BPA对青春期雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究
　　目的：探讨BPA对青春期雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制的影响。
　　方法：用不同浓度的BPA（0、2、10、50 mg/kg bw）隔天对青春期雄性大鼠染毒10次，20天后处死动物，称量体重与脏器重量；利用试剂盒测量血清与睾丸组织中的SOD，GSH-Px活力以及MDA含量；测量睾丸组织中的果糖含量；采用ELISA法测量血清FSH、LH与睾酮水平；使用HE染色和透射电镜观察睾丸的组织结构与超微结构；并用TUNEL法观察睾丸组织中细胞凋亡情况；分别用RT-PCR、Western blotting和免疫组化法来检测睾丸组织中Akt、mTOR、线粒体凋亡以及自噬通路上相关基因以及蛋白的表达情况；最后，使用计算机辅助精子分析（CASA）系统以及精子涂片法测定BPA染毒后对青春期雄性大鼠精子质量的影响。
　　结果：染毒前后，各染毒组体重与脏器系数与对照组相比均无统计学差异。与对照组相比，血清及睾丸组织中氧化应激水平升高，睾丸组织中果糖含量减少，血清性激素出现不同程度下降，睾丸组织结构与超微结构发生异常改变，电镜检测发现高剂量组中自噬增强，TUNEL结果显示，BPA染毒后青春期大鼠睾丸组织中细胞凋亡增加。RT-PCR、Western blotting和免疫组化结果显示睾丸组织内Akt通路、线粒体凋亡通路、自噬通路被激活，mTOR通路被抑制。对精子质量的检测结果表明BPA暴露可导致青春期大鼠精子质量下降。
　　结论：BPA暴露可导致青春期大鼠内分泌紊乱及氧化应激。并激活睾丸组织内Akt、线粒体凋亡通路以及自噬通路，并抑制mTOR通路。诱导睾丸组织内凋亡、自噬发生，最终导致大鼠精子质量下降。
　　第二部分 BPA对成年期雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究
　　目的：探讨BPA对成年期雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制的影响。
　　方法：用不同浓度的BPA（0、2、10、50 mg/kg bw）隔天对成年期雄性大鼠染毒20天后，处死动物，称量体重与脏器重量；利用试剂盒测量血清与睾丸组织中的SOD，GSH-Px活力以及MDA含量；测量睾丸组织中的果糖含量；采用ELISA法测量血清FSH、LH与睾酮水平；使用HE染色观察组织结构；并用TUNEL法观察睾丸组织中细胞凋亡情况；采用Western blotting法来检测睾丸组织中 Akt/mTOR、以及 ERK通路上相关基因以及蛋白的表达情况；最后，使用CASA以及精子涂片法测量BPA染毒后对青春期雄性大鼠精子质量的影响。
　　结果：染毒前后，各染毒组体重与对照组相比均无统计学差异，肝脏的脏器系数在高剂量组显著降低。与对照组相比，血清及睾丸组织中氧化应激水平升高，睾丸组织中果糖含量减少，血清性激素水平出现不同程度下降，睾丸组织结构在染毒组中发生异常改变，TUNEL结果显示睾丸组织中细胞凋亡增加。Western blotting和免疫组化结果显示睾丸组织内ERK通路被激活，Akt/mTOR通路被抑制。对精子质量的检测结果表明BPA暴露后成年期大鼠精子质量下降。
　　结论：BPA染毒可引起成年期大鼠睾丸组织氧化应激以及内分泌紊乱，并可抑制睾丸组织内Akt/mTOR信号转导通路，激活ERK信号转导通路。最终导致成年期大鼠睾丸组织细胞凋亡增加，精子质量下降。
　　第三部分、孕后期BPA暴露对子代雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究
　　目的：探讨孕后期 BPA暴露对子代雄性 SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究。
　　方法：用不同浓度的BPA（0、1、10、100 mg/kg bw）在孕后期（GD14~21）对孕鼠灌胃染毒8天后，分别对21日龄以及50日龄子代雄鼠分别进行实验。处死动物，称量体重与脏器重量；利用试剂盒测量血清与睾丸组织中的SOD，GSH-Px活力以及MDA含量；测量睾丸组织中的果糖含量；采用ELISA法测量血清FSH、LH与睾酮水平；使用HE染色观察睾丸的组织结构；并用荧光TUNEL法观察睾丸组织中细胞凋亡情况；分别用RT-PCR、Western blotting和荧光免疫法来检测睾丸组织中 Akt、mTOR、线粒体凋亡以及自噬通路上相关基因以及蛋白的表达情况；最后，使用CASA以及精子涂片法测量50日龄雄性大鼠精子质量。
　　结果：孕期暴露后，在高剂量组子代雄鼠中发现脐疝畸形，21日龄子代雄鼠体重以及睾丸、肝脏、肺脏的脏器系数异常改变，50日龄子代雄鼠肝脏和脾脏的脏器系数异常改变。两个年龄段的子代雄鼠睾丸组织内氧化应激指标升高，血清性激素水平异常降低，21日龄子代雄鼠睾丸组织结构异常改变。RT-PCR、Western blotting和荧光免疫结果显示在21日龄子代雄鼠睾丸组织中Akt/mTOR通路受到抑制，线粒体凋亡通路被激活，自噬通路未受影响，50日龄子代雄鼠睾丸组织中Akt/mTOR通路部分受到抑制，线粒体凋亡通路部分被激活，自噬通路可能受到一定抑制。精子检测结果显示，与对照组相比，精子密度和活动精子密度在低、中剂量组显著下降，精子畸形率在低、高剂量组显著上升，精子动力学指标在低剂量组下降最为显著。
　　结论：孕后期 BPA暴露能导致子代雄性 SD大鼠内分泌紊乱及氧化应激。并抑制睾丸组织内Akt/mTOR信号转导通路、激活线粒体凋亡通路，诱导睾丸组织内凋亡，最终导致大鼠精子质量下降。虽然随着年龄增长，BPA的毒作用效果逐渐减弱，但其深远影响仍不可忽视。

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中英文缩略词表

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前言

第一部分、BPA对青春期雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究

材料与方法

结果

讨论

小 结1

第二部分、BPA对成年期雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究

材料与方法

结果

讨论

小结2

第三部分、孕后期BPA暴露对子代雄性SD大鼠生殖毒作用影响及其机制研究

材料与方法

结果

讨论

小结3

参考文献

总结

综述: 围生期双酚A暴露对子代的危害

附录

致谢