跨膜型和分泌型TNF-α在非可控性炎症恶性转化中的作用

摘要

在非可控性炎症的恶性转化中，促炎因素可能主要参与肿瘤发生，而抗炎因素则主要通过抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤发展。已知促炎细胞因子—可溶性TNF-sTNF-α通过促进炎症在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用，而跨膜型TNF-α（tmTNF-α）在这一病理过程中的作用尚不清楚。本课题利用AOM/DSS制备小鼠慢性结肠炎癌变模型，通过观察内源性两型TNF-α在结肠炎恶变过程（急性炎症期、慢性炎症期和肿瘤期）中的时空动态变化和分析内源性两型TNF-α与促炎和抑炎细胞及分子时空变化的关系，并用tmTNF-α抗体改变tmTNF-α表达的时间窗，干扰非可控性炎症的恶性转化，不但可以阐明tmTNF-α在非可控性炎症恶性转化中的作用，且为早期诊断和阻止慢性炎症向肿瘤恶变提供了干预的新靶点和新线索。其主要研究结果如下：
　　一、内源性跨膜型TNF-α和分泌型TNF-α在非可控性结肠炎癌变中与促炎和抗炎细胞及分子变化的相关性
　　1.慢性结肠炎癌变模型：
　　（1）慢性结肠炎癌变模型临床指征的变化：给C57BL/6J小鼠腹腔注射AOM(10mg/kg)一周后，给小鼠2.5％DSS饮水，持续5天，换用正常饮水两周，如此重复3个循环造模。在每轮给予2.5％DSS饮水后，小鼠出现体重下降，结肠缩短，粪便潜血、甚至直肠出血，而在给予两周正常饮水后这些症状均可得到缓解。
　　（2）慢性结肠炎癌变：第3个循环出现恶变，肿瘤好发于结肠的直肠端，每只小鼠的平均荷瘤量在10个左右，肿瘤的平均直径在4~5mm左右。
　　（3）慢性结肠炎癌变过程中结肠组织的病变：第一循环为急性炎症期，HE染色显示肠上皮缺失、大量炎症细胞浸润至结肠固有层；间隔2w后其肠结构接近恢复正常。第二循环为慢性非可控性炎症期，炎症细胞可浸润至粘膜下层，间隔2w后小鼠肠腺大量增生。第三循环初期出现腺瘤，腺腔细胞排列不规则，而后期恶性肿瘤细胞增多，进入肿瘤期。
　　2.促炎和抑炎细胞在慢性结肠炎癌变过程中的变化：
　　（1）促炎细胞在慢性结肠炎癌变中数量与表型的变化：流式细胞术与免疫组化结果表明：脾脏和肠系膜淋巴结中巨噬细胞在急性炎症恢复期与非可控炎症恶变期达高峰，在肿瘤期反而减少；结肠组织巨噬细胞包括M1与M2巨噬细胞则在慢性炎症恶变期明显升高。与之不同，脾脏中Th17细胞在整个发病过程中均有不同程度增加，但在急性炎症恢复期达高峰；而肠系膜淋巴结与结肠组织中Th17细胞在肿瘤期达高峰。
　　（2）Treg细胞在慢性结肠炎癌变中的变化：流式细胞术与免疫组化结果表明：脾脏Treg细胞在急性炎症期即升高到较高水平，但在肿瘤期则明显下降；肠系膜淋巴结Treg细胞只在DSS诱导的损伤时升高，而在间歇期下降；结肠组织Treg细胞在非可控性炎症恶变期明显升高，且可浸润至粘膜下层。
　　3.促炎及抑炎分子在慢性结肠炎癌变中的变化：
　　（1）Th1与Th2型细胞因子的变化：ELISA结果表明：病变结肠组织培养上清与结肠组织匀浆中IFN-γ在DSS引起的炎症损伤中增高，在间歇期中减少；IL-4水平很低，且其动态变化与IFN-γ相反。提示本模型主要为Th1介导的炎症反应。
　　（2）促炎与抑炎细胞因子的变化：ELISA与Griess法结果表明：结肠组织培养上清与结肠组织匀浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和NO主要在DSS引起的炎症损伤中升高，间歇期均有明显下降。反之，病变结肠组织匀浆中的抑炎因子IL-10和TGF-β在DSS引起的炎症期量少，间歇期则增加；而在结肠组织培养上清中炎症期增加，间歇期则减少。此外，肿瘤期抑炎细胞因子升高幅度比促炎细胞因子大，提示抑炎因子在肿瘤发展中的重要作用。
　　4.两型TNF-α在慢性结肠炎癌变中的变化：
　　（1）血清及结肠组织匀浆TNF-α的变化：ELISA结果表明：血清中sTNF-α急性炎症期开始轻度增高，恢复期至高峰，此后下降，肿瘤期再度回升；而病变组织匀浆中总TNF-α在急性炎症期增高，此后下降，到肿瘤期再度增高。
　　（2）结肠组织中分泌型与跨膜型TNF-α比例的变化：ELISA结果证实：病变结肠组织培养上清sTNF-α在急、慢性炎症期显著升高，因此tmTNF-α/sTNF-α的比例明显降低；而结肠组织膜蛋白中tmTNF-α在慢性炎症恶变呈高表达，因而二者的比例亦增高。
　　（3）结肠组织tmTNF-α的细胞来源：免疫组化结果表明：在急慢性炎症阶段主要是病变组织浸润细胞表达tmTNF-α，而在非可控性炎症恶变期主要是增生的腺瘤上皮细胞表达tmTNF-α。分离结肠上皮细胞，只有到非可控性炎症恶变期才上调tmTNF-α的表达。故tmTNF-α可能作为预警结肠炎癌变的标志物。
　　（4）结肠组织两型TNF-α的表达与促炎及抑炎细胞因子的相关性：结肠组织sTNF-α含量与结肠组织匀浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和NO含量呈正相关，与抑炎因子IL-10和TGF-β含量则呈负相关；而结肠组织tmTNF-α含量与结肠组织匀浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和NO含量呈负相关，与抑炎因子IL-10呈正相关。
　　（5）结肠组织tmTNF-α的表达与Treg的相关性：结肠组织中tmTNF-α表达阳性率与Foxp3+Treg细胞数量呈正相关。
　　二、tmTNF-α抗体对非可控性炎症恶性转化的阻断作用
　　1.tmTNF-α抗体在体内可有效阻断tmTNFα转换：在第一轮DSS停药当天即开始给予小鼠tmTNF-α抗体治疗，每周两次，每次600g/只小鼠，结果证实tmTNF-α抗体可使病变结肠组织表达tmTNF-α明显增加，分泌sTNF-α显著减少。
　　2.tmTNF-α抗体可减缓非可控性结肠炎恶变：tmTNF-α抗体使结肠肿瘤个数及直径均明显减少；可明显抑制慢性结肠炎癌变鼠的脾脏肿大；但对DSS所致小鼠体重的减轻及小鼠粪便潜血等临床症状未见明显改善。
　　3.tmTNF-α抗体对病变结肠组织产生促炎和抑炎细胞因子的影响：用ELISA和Griess法证实：tmTNF-α抗体不影响结肠组织匀浆及组织培养上清中产生的IFN-γ及IL-4；可明显抑制结肠组织匀浆及培养上清中IL-1β、IL-6和NO的产生；可明显增加结肠组织匀浆及培养上清中IL-10含量，而不影响其TGF-β的产生；
　　4.tmTNF-α抗体对病变结肠组织中巨噬细胞和Th17细胞的影响：免疫组化证实：tmTNF-α抗体可明显抑制结肠组织中F4/80阳性巨噬细胞的浸润，特别是M1型巨噬细胞浸润，对M2型巨噬细胞无影响；对病变结肠组织中IL-17阳性细胞的浸润也无显著影响。
　　综上所述，系统免疫和粘膜免疫均参与非可控性炎症恶性转化的各个病程。sTNF-α主要在急慢性炎症期增高，与促炎细胞与分子事件相关，而tmTNF-α则在非可控性炎症恶变期增高，与抑炎细胞与分子事件相关，提示sTNF-α通过促炎促进肿瘤发生，而tmTNF-α通过抑制免疫，促进肿瘤发展。用tmTNF-α抗体使tmTNF-α表达时间窗提前至急性炎症期可明显抑制非可控性炎症恶变。本课题的研究结果不但有助于阐明非可控性炎症恶性转化中新的分子机制，而且为阻断非可控性炎症恶化提供新的线索和新型靶向抗体。

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