骨形成相关因子和1,25(OH)2D3/VDR在肾结石形成机制中的研究

摘要

目的：
　　通过构建的遗传性高钙尿大鼠模型，探讨骨形成相关因子和1,25(OH)2D3/VDR在肾结石形成中的作用。
　　方法：
　　1.18只大鼠被分成2组，10只20代高钙尿大鼠作为实验组，8只体重与高钙尿大鼠相当的SD大鼠作为对照组。大鼠处死后取出肾脏，应用RT-PCR和Western blot分别检测两组大鼠肾组织中BMP2,Runx2,Osterix,MSX2,OPN和ALP在mRNA和蛋白水平的表达。
　　2.45只22代高钙尿大鼠和30只23代高钙尿大鼠被分成三组，每组25只，分别为生理盐水组，VDR干扰组和空病毒组。在实验开始前和开始后的第3、7、14和28天，每组分别处死5只高钙尿大鼠，检测两组大鼠肾组织中BMP2,Runx2,Osterix和OPN在mRNA和蛋白水平的表达；应用Van kossa染色法显示肾组织钙化情况；应用免疫组化法检测OPN的表达。
　　3.取高钙尿大鼠肾脏，分离、培养肾小管上皮细胞。将肾小管上皮细胞分别用生理盐水，VDR慢病毒载体和空病毒载体进行处理，在细胞处理后6，12，24，48和96小时后分别收集细胞，检测处理前后不同时间点BMP2,Runx2和Osterix在mRNA和蛋白水平的表达。同时检测VDR干扰前后细胞钙化的变化。
　　4.在细胞培养基中加入1,25(OH)2D3，共同孵育6，12，24，48和96小时后分别收集细胞，检测孵育前后不同时间点BMP2,Runx2和Osterix在mRNA和蛋白水平的表达。同时检测1,25(OH)2D3处理前后细胞钙化的变化。
　　结果：
　　1.骨相关因子在高钙尿大鼠和SD大鼠中的表达：RT-PCR结果显示，BMP2(p<0.01), Runx2(p=0.045), Osterix(p=0.001)和OPN(p<0.01)在高钙尿大鼠肾组织中的表达明显增高。但是两组中MSX2(p=0.088)和ALP(p=0.116)的表达没有统计学意义（p＞0.05）。Western blot结果与RT-PCR结果相似。
　　2.VDR对BMP2通路信号相关分子的调控作用：RT-PCR结果显示，VDR干扰组中BMP2,Runx2和Osterix的表达水平在实验开始后的第7,14和28天明显降低，而在生理盐水组和空病毒组中，BMP2,Runx2和Osterix的mRNA表达水平在各个时间点均无明显变化。Western blot结果同样显示，VDR基因沉默降低了高钙尿大鼠肾组织中BMP2,Runx2和Osterix的蛋白表达水平。
　　3.VDR对高钙尿大鼠肾组织中钙磷沉积的调控作用：Van kossa染色结果显示，钙磷沉积于高钙尿大鼠皮质和髓质的肾小管内。VDR基因沉默后，肾小管内的钙磷沉积在实验开始后的第7,14和28天明显降低，但是在空病毒组中，直到处理后的第28天，肾小管内的钙磷沉积依然无明显变化。
　　4.VDR对OPN的调控作用：RT-PCR结果显示，VDR基因沉默后，OPN的表达水平在实验开始后的第7,14和28天明显降低，并且在第14天达到了最低水平。Western blot显示出了与RT-PCR相似的结果。免疫组化结果显示，OPN表达于高钙尿大鼠肾小管上皮细胞的胞质，而且OPN在肾皮质和髓质的表达均较为丰富，但VDR基因沉默后，OPN在肾小管上皮细胞中的表达明显降低。
　　5.VDR基因沉默对肾小管上皮细胞内骨相关因子表达的影响:RT-PCR结果显示，VDR慢病毒载体转染后，BMP2,Runx2和Osterix的表达明显降低(P<0.01)，并且随着转染时间的延长，其下降程度越来越明显，Western blot显示出了与RT-PCR相似的结果。
　　6.VDR基因沉默对肾小管上皮细胞钙化的影响：采用Yang Hsueh的方法对细胞钙化进行检测，其结果显示，VDR干扰组中肾小管上皮细胞钙化水平明显降低，而在生理盐水组和空病毒组中，肾小管上皮细胞钙化水平在各个时间点均无明显变化。
　　7.1,25(OH)2D3对肾小管上皮细胞内骨相关因子表达的影响：RT-PCR结果显示，肾小管上皮细胞与1,25(OH)2D3共同孵育12小时后，BMP2,Runx2和Osterix的表达水平开始持续升高，在孵育96小时后，BMP2,Runx2和Osterix的表达水平升高了2倍。Western blot结果显示，肾小管上皮细胞与1,25(OH)2D3共同孵育后，BMP2,Runx2和Osterix的蛋白表达水平明显升高。
　　8.1,25(OH)2D3对肾小管上皮细胞钙化的影响：应用Von Kossa法对肾小管上皮细胞进行染色，其结果显示，1,25(OH)2D3与肾小管上皮细胞共同孵育96h后，VD3组胞质内出现矿物沉积的细胞较多，并且染色更深，对照组仅有少量细胞胞质内出现矿物沉积的现象。同时Yang Hsueh法的结果显示，1,25(OH)2D3与肾小管上皮细胞共同孵育12小时后，细胞内的钙磷沉积开始持续升高，在孵育96小时后，VD3组中BMP2,Runx2和Osterix的表达水平升高了2.14倍。
　　结论：
　　1.BMP2，Runx2，Osterix和OPN可能在特发性高钙尿大鼠肾结石的形成过程中发挥重要作用。
　　2.1,25(OH)2D3/VDR可能通过BMP2信号通路及OPN的表达在肾结石形成中发挥重要的调控作用。

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缩略语表

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英文摘要

第一部分 慢病毒载体介导RNAi抑制VDR表达对遗传性高钙尿大鼠肾脏内骨形成相关因子及肾结石形成的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 1,25(OH)2D3/VDR对肾小管上皮细胞骨形成相关因子及细胞钙化的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

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