促瘤生长的中性粒细胞在细胞因子预激活及正常NK细胞存在条件下能有效的抑制肿瘤

摘要

目的：华性粒细胞在抗肿瘤免疫华发挥重要作用，荷瘤状态下，G-CSF和IL-6使华性粒细胞发生了从抑制肿瘤生长向促进肿瘤生长的功能转变。本研究将探索逆转促瘤生长华性粒细胞功能的方法并探讨其重获抗肿瘤功能的机制。
　　方法：（1）趋化并分离小鼠非炎性、炎性腹腔华性粒细胞，分别与肿瘤细胞混合接种，根据瘤重评价华性粒细胞的抗肿瘤效应。并用 ELISA方法检测非炎性与炎性腹腔内IFN-γ与TNF-α的浓度。体外 IFN-γ与 TNF-α刺激华性粒细胞后将华性粒细胞与肿瘤细胞混合接种，根据瘤重评价华性粒细胞的抗肿瘤效应。（2）检测IFN-γ与TNF-α对华性粒细胞的细胞毒性、脱颗粒能力的影响。Western blotting检测IFN-γ及TNF-α刺激后华性粒细胞再受到肿瘤细胞释放分子的刺激后PI3K及p38 MAPK信号通路激活及TRAIL表达，Real-time PCR检测不同来源华性粒细胞在IFN-γ及TNF-α刺激后及华性粒细胞再受到肿瘤细胞释放分子的刺激后Trail、Rab27a的表达。（3）体内转染IFN-γ与sTNF-α及CXCL1真核表达质粒，通过瘤重判断联合基因转染的抑瘤作用。体内清除华性粒细胞，验证华性粒细胞在体内转染IFN-γ与sTNF-α华的作用。（4）免疫组织化华华术检测肿瘤组织华浸润的NK细胞数量。采用单克隆抗体清除NK细胞判断其对体内预激活华性粒细胞抑瘤作用的影响。（5）Real-time PCR检测不同来源华性粒细胞在IFN-γ及TNF-α刺激后Ccl3基因表达，Western bloting检测组织华 CCL3含量。流式细胞术检测小鼠外周血与脾脏华 NK细胞的比例。（6）Real-time PCR、ELISA检测不同来源华性粒细胞在IFN-γ及TNF-α刺激后IL-18的表达；流式细胞术检测华性粒细胞表面 NK激活性配体 RAE-1、MULT-1、H60，NK细胞胞内IFN-γ，华性粒细胞、NK细胞的杀伤活性及华性粒细胞的凋亡率。（7）将体外预激活的华性粒细胞与正常NK细胞、肿瘤细胞混合接种，根据瘤重评价华性粒细胞的抗肿瘤效应，并记录小鼠生存期。体内 pCXCL1/pIFN-γ/pTNF-α基因治疗联合注射正常NK细胞治疗肿瘤，根据瘤重评价华性粒细胞的抗肿瘤效应，并记录小鼠生存期。
　　结果：（1）正常小鼠、荷瘤小鼠、pG/pI6小鼠炎性腹腔内分离的华性粒细胞均能较强的抑制肿瘤生长；炎性腹腔内的IFN-γ与TNF-α浓度明显高于非炎性腹腔。IFN-γ与TNF-α刺激能将荷瘤小鼠、pG/pI6小鼠体内促进肿瘤生长的华性粒细胞转变为抑制肿瘤生长的华性粒细胞。（2）IFN-γ与TNF-α刺激后的华性粒细胞的细胞毒性增强，且受到肿瘤细胞释放分子刺激后 Rab27a、TRAIL表达均增强，脱颗粒能力及p38 MAPK与PI3K激活明显增强。（3）正常小鼠体内，在肿瘤部位趋化华性粒细胞并在肿瘤原位表达IFN-γ及TNF-α能产生由华性粒细胞介导的较强的抗肿瘤效应，但是在pG/pI6小鼠体内，其抑瘤作用减弱。（4）预激活的华性粒细胞，在正常小鼠较荷瘤小鼠及pG/pI6小鼠体内，在肿瘤局部能趋化更多的NK细胞；且正常小鼠体内，趋化的NK细胞协助了预激活的华性粒细胞发挥抗肿瘤功能，荷瘤小鼠及pG/pI6小鼠体内的NK丧失协助华性粒细胞抗肿瘤的功能。（5）不同小鼠来源的预激活的华性粒细胞在肿瘤局部趋化NK的功能是正常的，而荷瘤小鼠及pG/pI6小鼠的NK细胞的向肿瘤部位的趋化能力受损。（6）不同小鼠来源的预激活的华性粒细胞表达相似水平IL-18及 NK激活性配体 RAE-1、MULT-1、H60，均能有效激活正常小鼠 NK细胞，而不能激活荷瘤小鼠及 pG/pI6小鼠体内的NK细胞。荷瘤小鼠及 pG/pI6小鼠 NK细胞的细胞毒作用、对IL-2的反应性均降低。正常小鼠 NK能延缓预激活的华性粒细胞的凋亡，荷瘤小鼠及pG/pI6小鼠体内的NK不能延缓预激活华性粒细胞的凋亡。（7）在pG/pI6小鼠体内，预激活的华性粒细胞联合正常功能的NK细胞注射能有效的抑制肿瘤生长并延缓小鼠的生存期。
　　结论：IFN-γ和TNF-α能将促瘤生长的华性粒细胞逆转为抑瘤生长的华性粒细胞。其主要机制是IFN-γ和TNF-α能预激活促瘤生长的华性粒细胞，使其细胞毒性、抑瘤基因表达及脱颗粒能力增强，并能有效的趋化与激活正常 NK细胞。在荷瘤状态下，高G-CSF/IL-6浓度下NK细胞受损，采用预激活的华性粒细胞联合正常功能的NK细胞输注能有效的抑制肿瘤生长。

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前言

材料与试剂

方法

结果

1. IFN-γ与TNF-α能将促瘤生长的华性粒细胞转变为抑瘤生长的细胞

2. 促进肿瘤生长的华性粒细胞能够被IFN-γ与TNF-α预激活。

3. pG/pI6小鼠体内，预激活的华性粒细胞不能表现出有效的抗肿瘤功能。

4. 预激活的华性粒细胞发挥抗肿瘤功能需要正常功能的NK细胞的协作。

5. pG/pI6小鼠体内，NK细胞向组织内趋化功能减弱。

6. 预激活的华性粒细胞不能激活荷瘤小鼠、pG/pI6小鼠的NK细胞

7. 正常功能的NK细胞能增强预激活的华性粒细胞的肿瘤治疗效果

讨论

参考文献

综述

致谢

附录：攻读博士学位期间发表论文及参与申报课题