新型天然产物EPLE抗结直肠癌及NMHC抗白血病的作用和机制研究

摘要

第一部分新型对映贝壳杉烷型二萜EPLE抗结直肠癌的作用及机制研究
　　目的：结直肠癌是目前发病率极高的恶性肿瘤。尽管早期结直肠癌通过外科切除可取得较好的疗效，但由于远端转移的晚期结直肠癌化疗、放疗效果都不明显，目前仍没有理想的治疗方法。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与结直肠癌的发生有着密切关系，这一部分工作研究从贵州鼠尾草中分离得到的对映贝壳杉烷型二萜类新型小分子化合物（EPLE）通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抗结直肠癌的作用及其机制。
　　方法：以多种结直肠癌细胞株、患者原代样本和小鼠异源移植模型为研究对象，采用细胞生物学与分子生物学技术，研究EPLE抗肿瘤的机制。采用MTT法及软琼脂克隆实验检测化合物对多种结直肠癌细胞的毒性作用；运用流式细胞技术和免疫印迹法检测细胞周期和凋亡以及相关蛋白的表达水平变化，荧光定量PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的mRNA表达水平变化；构建双荧光素酶报告基因系统检测 Wnt/β-catenin信号通路的活性变化。我们还采用免疫共沉淀的方法检测EPLE对β-catenin/TCF4转录复合物形成的阻断作用；计算机模拟EPLE阻断β-catenin/TCF4相互作用的结构图示。体内实验中通过裸鼠结直肠癌细胞移植瘤模型，检测EPLE对移植瘤生长、肿瘤细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响。
　　结果： EPLE可特异性抑制人结直肠癌细胞系及原代肿瘤样本的增殖而对正常结肠上皮细胞增殖无明显抑制作用且呈良好的剂量及时间依赖性。EPLE可诱导结直肠癌细胞发生凋亡。机制研究显示EPLE直接靶向Wnt/β-catenin信号通路，阻断β-catenin/TCF4复合物的形成，抑制β-catenin转录激活下游靶基因的表达。EPLE与现有的结直肠癌化疗药物五氟尿嘧啶联合使用具有一定的协同作用，而且单独使用即可抑制结直肠癌移植瘤小鼠模型的肿瘤生长，并诱导体内肿瘤细胞发生凋亡。
　　结论：EPLE对结直肠癌细胞具有显著而特异性的细胞毒作用，通过直接抑制Wnt/β-catenin信号通路，阻断β-catenin与TCF4的相互作用，抑制TCF4/?-catenin转录复合物的活性，而发挥其抗肿瘤作用。
　　第二部分新型石蒜科生物碱NMHC抗急性髓细胞白血病的作用及机制研究
　　目的：急性髓细胞白血病(AML)表现为骨髓中造血干细胞的恶性增殖，是一种常见的恶性血液肿瘤，近年来尽管联合化疗和造血干细胞移植取得了较大的进展,但大多数患者仍然死于耐药、复发或并发症，因此临床急需寻找更加有效的治疗药物。最新病理机制研究表明 NOTCH信号通路的激活在 AML中表现为肿瘤抑制的活性。本实验主要研究石蒜科葱莲属植物葱莲中提取的生物碱NMHC对AML的抗肿瘤药效及其作用机制，可能为将来有效治疗AML提示新思路。
　　方法：以多种白血病细胞系为研究对象，采用CCK8法检测受试药物NMHC对白血病细胞的毒性，流式细胞技术与蛋白质印迹法检测 NMHC对AML细胞周期和凋亡的影响。为深入探索化合物诱导白血病细胞凋亡的分子机制，我们进行了全基因组表达谱基因芯片分析和KEGG信号通路基因的富集分析，并通过荧光定量 PCR、双荧光素酶报告基因和免疫印迹的方法验证 NMHC处理后NOTCH1靶基因的表达变化。进一步在AML细胞中稳定表达MAML的负显性形式DNMAML以专一性的阻断NOTCH信号，通过追踪GFP表达百分比检测内源性阻断NOTCH能否能挽救NMHC引起的细胞凋亡。
　　结果：我们发现受试药物NMHC可显著抑制髓系细胞白血病的增殖并诱导细胞凋亡，而对淋巴细胞白血病的毒性较弱。全基因组表达谱分析发现，NMHC处理后NOTCH信号通路的相关基因明显上调，提示NMHC能激活NOTCH信号通路。后续实验证实，NMHC可有效促进 NOTCH下游靶基因的表达，增强活性形式ICN的蛋白表达，双荧光素酶报告基因实验结果表明NMHC处理后能直接激活ICN的转录。而且，NMHC与NOTCH激活多肽DLL4联用对下游靶基因的激活具有协同作用，通过表达负显性形式DNMAML阻断NOTCH信号通路能部分挽救NMHC引起的细胞凋亡。
　　结论：新型石蒜科生物碱NMHC对急性髓系白血病细胞具有特异性的杀伤的作用。NMHC可能通过激活具有抑癌功能的 NOTCH信号通路而发挥抗白血病的作用。

目录

封面

声明

目录

缩略语

中文摘要

英文摘要

第一部分 新型对映贝壳杉烷型二萜EPLE抗结直肠癌的作用及机制研究

绪论

1.材料与方法

1.1 实验细胞、动物及实验药物

1.2 实验仪器及耗材

1.3 实验试剂

1.4 实验方法

2. 实验结果

2.1 EPLE对结直肠癌细胞的特异性细胞毒作用

2.2 EPLE诱导结直肠癌细胞凋亡

2.3 EPLE直接靶向wnt/β-catenin信号通路发挥抗结直肠癌的作用

2.4 EPLE阻断β-catenin/TCF-4复合物的形成

2.5 EPLE与现有结直肠癌化疗药物五氟尿嘧啶联合给药对结直肠癌细胞的杀伤具有协同作用

2.6 EPLE抑制HCT116细胞裸鼠移植瘤的生长

3.讨论

第二部分 新型石蒜科生物碱NMHC抗急性髓细胞白血病的促凋亡作用及机制研究

绪论

1.材料与方法

1.1 实验细胞、动物及实验药物

1.2 实验仪器及耗材

1.3 实验试剂

1.4 实验方法

2. 实验结果

2.1 NMHC对AML细胞的特异性细胞毒作用

2.2 NMHC影响AML细胞周期进程

2.3 NMHC诱导AML细胞凋亡

2.4 NMHC处理HL-60细胞的表达谱基因芯片分析

2.3 NMHC通过靶向NOTCH信号通路发挥抗AML的作用

2.4 NMHC与NOTCH信号通路激活剂DLL4联用对NOTCH信号通路的激活效应具有协同作用

2.5 过表达DNMAML对NMHC处理的AML细胞生长的影响

3. 讨论

参考文献

综述：Wnt信号通路与人类疾病的关系研究进展

学位申请人攻读学位期间发表的学术论文

致谢