脊髓趋化因子受体CXCR3介导骨癌痛发生和维持的机制

摘要

由于环境污染的加剧，特别是雾霾、重金属污染的流行，禁烟运动的失败，以及食品卫生造假贩假的猖獗等诸多因素，我国公民身心健康受到严重的威胁，随之而来的是乳腺癌、肺癌、前列腺癌症的高发化与年轻化。乳腺癌、肺癌、前列腺癌具有极高的骨转移性，而骨癌痛（bone cancer pain，BCP）则成为其常见的并发症。
　　由于 BCP的发生机制尚未研究明了，目前临床上缺乏治疗 BCP的有效方法，因此广大患者正在饱受着BCP的摧残。所以，深入研究BCP的发病机制，为研发有针对性的治疗药物和治疗手段提供理论依据显得迫在眉睫。
　　目前发现的20余种趋化因子受体可被分为C、CC、CXC、CX3C四种类型。近年来的研究证实，趋化因子家族广泛参与疼痛的调节，包括 BCP。如 CCL2、CCL5等在骨癌痛模型中显著上调；抑制趋化因子受体 CX3CR1可减轻 BCP。CXCR3属于 CXC类型趋化因子受体之一，本课题组前期基因芯片研究证实，BCP大鼠脊髓腰膨大部位CXCL10/ CXCR3显著上调，并且证实CXCL10/ CXCR3通过激活小胶质细胞介导BCP的发生。但是具体的外周与中枢的细胞、分子机制尚未阐明。
　　Akt作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）的主要下游信号分子。Akt在细胞功能的调控中具有相当重要的作用。如诸多的研究证明，Akt的活化参与细胞存活与凋亡的调控；更重要的是，Akt广泛表达于脊髓，特别是脊髓背角I-IV板层，参与各种刺激引起的痛觉过敏。CXCR3属于G蛋白偶联受体（Guanosine-binding protein coupled receptors，GPCRs）家族。PI3K通路受GPCRs（包括趋化因子受体）调控。并且CXCR3的上调可激活Akt。因此我们猜测，脊髓水平PI3K的下游Akt可能作为CXCR3的下游，参与介导BCP的发生和维持。
　　胞外信号调节酶（Extracellular signal-regulated kinases，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族成员之一，可以把一系列胞外信号信息传递到细胞内。如 ERK信号通路在突触和神经元可塑性上发挥着重要作用。并且 ERK广泛参与调节各种伤害性刺激和伤害性信息所诱导的外周、中枢神经敏感化。CXCR3的上调可激活 ERK。因此我们猜测，脊髓水平 ERK可能作为 CXCR3的下游，参与介导BCP的发生与维持。
　　PI3K/ Akt与Raf/ MEK/ ERK之间存在相互调节关系。假如Akt与ERK同时作为CXCR3的下游介导 BCP的发生，那么 BCP条件下两者间也可能存在相互调节(crosstalk)。
　　因此，本研究拟通过western blot、免疫荧光、神经药理学与行为学相结合的方法，深入研究 CXCR3参与 BCP具体的细胞、分子机制，为研发有针对性的治疗药物和治疗手段提供理论依据。
　　研究方法和结果
　　一、CXCR3在骨癌痛发生发展中的作用
　　方法：实验一、采用western blot及免疫荧光方法研究BCP发生过程中脊髓水平CXCR3表达时间相与分布，及 CXCR3与神经元、胶质细胞共表达情况；实验二、采用免疫荧光方法研究BCP发生过程中DRG水平CXCR3表达时间相，及与肽能、非肽能神经元和A型神经元共表达情况；实验三、研究 CXCR3特异性抑制剂 AMG487预处理及后处理对BCP机械痛阈的影响。
　　结果：BCP模型建立后，脊髓水平 CXCR3呈时间依赖性升高，并表达分布于脊髓背角 I-V板层，且与脊髓神经元（NeuN标记）、星形胶质细胞（GFAP标记）和小胶质细胞（IBA1）共表达； DRG水平CXCR3呈时间依赖性升高，并与非肽能神经元（IB4标记）、A型神经元（NF200标记）及肽能神经元（CGRP标记）共表达； CXCR3抑制剂AMG487预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。
　　二、Akt依赖CXCR3活化介导骨癌痛的发生和维持
　　方法：实验一、采用western blot及免疫荧光方法研究BCP发生过程中脊髓水平pAkt表达时间相及分布；实验二、采用免疫荧光方法研究 BCP发生过程中脊髓水平pAkt表达分布及与CXCR3共表达情况；实验三、采用western blot方法研究CXCR3抑制剂AMG487对BCP诱发的pAkt表达上调的影响；实验四、研究Akt上游PI3K抑制剂wortmannin预处理及后处理对BCP机械痛阈的影响。
　　结果：BCP模型建立后，脊髓水平 pAkt呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角I-V板层；脊髓pAkt与CXCR3存在共表达；AMG487明显抑制BCP引起的pAkt上调；PI3K抑制剂wortmannin预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。
　　三、ERK依赖CXCR3活化介导骨癌痛的发生和维持
　　方法：实验一、采用western blot及免疫荧光方法研究BCP发生过程中脊髓水平pERK1/2表达时间相及分布；实验二、采用免疫荧光方法研究 BCP发生过程中脊髓水平pERK1/2表达分布及与CXCR3共表达情况；实验三、采用western blot方法研究CXCR3抑制剂AMG487对BCP诱发的pERK1/2表达上调的影响；实验四、研究ERK上游MEK抑制剂U0126预处理及后处理对BCP机械痛阈影响。
　　结果：BCP模型建立后，脊髓水平pERK1/2呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角 I-V板层；脊髓 pERK1/2与 CXCR3存在共表达；AMG487明显抑制 BCP引起的pERK1/2上调；MEK抑制剂U0126预处理或后处理分别地显著预防或逆转双侧机械痛阈。
　　四、Akt与ERK相互调控介导骨癌痛的发生和维持
　　方法：实验一、研究鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin对骨癌痛诱发的pAkt表达上调的影响；实验二、研究鞘内注射 PI3K抑制剂 wortmannin对骨癌痛诱发的pERK1/2表达上调的影响；实验三、研究鞘内注射 MEK抑制剂 U0126对骨癌痛诱发的 pERK1/2表达上调的影响；实验四、研究鞘内注射 MEK抑制剂 U0126对骨癌痛诱发的pAkt表达上调的影响。
　　结果：鞘内注射PI3K抑制剂wortmannin可抑制骨癌痛诱发的pAkt表达上调；鞘内注射 PI3K抑制剂 wortmannin可抑制骨癌痛诱发的 pERK1/2表达上调；鞘内注射MEK抑制剂 U0126可抑制骨癌痛诱发的 pERK1/2表达上调；鞘内注射 MEK抑制剂U0126可抑制骨癌痛诱发的pAkt表达上调。
　　五、统计学处理
　　所有数据使用均数±标准误表达。计量资料两两比较使用t-检验。多组间比较使用单因素方差分析。行为学比较采用双因素方差分析，时间为组内因素，处理为组间因素。P<0.05认为差异有统计学意义。
　　研究总结
　　一、主要研究结果
　　1、BCP模型建立后，脊髓水平 CXCR3呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角 I-V板层，且与脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共表达；DRG水平 CXCR3呈时间依赖性升高，并与非肽能神经元、A型神经元及肽能神经元共表达；CXCR3抑制剂AMG487预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。
　　2、BCP模型建立后，脊髓水平 pAkt呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角 I-V板层；pAkt与 CXCR3存在共表达；AMG487抑制 BCP引起的 pAkt上调；PI3K抑制剂wortmannin预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。
　　3、BCP模型建立后，脊髓水平pERK1/2呈时间依赖性升高，并表达在脊髓背角I-V板层；pERK1/2与CXCR3存在共表达；AMG487抑制 BCP引起的 pERK1/2上调；MEK抑制剂U0126预处理或后处理分别显著地预防或逆转双侧机械痛阈。
　　4、鞘内注射 PI3K抑制剂 wortmannin可抑制骨癌痛诱发的 pAkt及 pERK1/2表达上调；鞘内注射MEK抑制剂U0126可抑制骨癌痛诱发的pERK1/2及pAkt表达上调。
　　二、研究结论
　　1、脊髓水平趋化因子受体CXCR3参与介导骨癌痛的发生和维持。
　　2、脊髓水平趋化因子受体CXCR3通过调控下游Akt与ERK的活性介导骨癌痛的发和维持。
　　3、脊髓水平Akt与ERK之间的相互调控是CXCR3参与介导骨癌痛的发生与维持的分子机制。
　　三、展望
　　1、本研究证实了 CXCR3通过其下游分子 Akt与 ERK的活化相关机制参与介导BCP的发生和维持，但是CXCR3如何调控Akt与ERK的具体机制有待进一步研究。
　　2、本研究发现CXCR3表达分布于脊髓神经元与胶质细胞，因此我们猜测CXCR3介导 BCP的发生与维持可能涉及神经元与胶质细胞之间的相互影响，但其具体信号传递仍有待研究。
　　3、本研究证实脊髓 Akt、ERK两者之间的相互调节参与介导 BCP的发生发展，但是其细胞核内机制尚有待深入研究。

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创新点概述

主要缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分 CXCR3在骨癌痛发生发展中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 Akt依赖CXCR3活化介导骨癌痛的发生和维持

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 ERK依赖CXCR3活化介导骨癌痛的发生和维持

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 Akt与ERK相互调控介导骨癌痛的发生和维持

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述: 免疫细胞、胶质细胞与疼痛相关性的研究进展

致谢

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