第一部分、单次可卡因暴露对小鼠伏隔核区细胞自噬的影响 目的：伏隔核（nucleus accumbens，NAc）是大脑奖赏环路的核心脑区，接受如海马、中脑腹侧被盖区、杏仁核的多巴胺能神经元投射，参与了物质成瘾（如酒精、药物）、性欲、食欲等奖赏行为和学习记忆的调节，以及神经精神系统疾病如抑郁症、阿尔兹海默病等的发病过程。自噬（autophagy）是细胞溶酶体降解受损细胞器和错误折叠蛋白的一种重要代谢途径，在氧化应激、药物毒性损伤以及神经退行性疾病的发生过程中激活并发挥保护作用。那么自噬活性的改变在单次可卡因暴露中发挥什么作用？目前尚未见报道。 方法：以单次生理盐水腹腔注射作为对照组，模型组给予单次腹腔注射可卡因（15mg/kg）后15min、30min、60min和120min提取NAc区蛋白，单次腹腔注射可卡因7.5、15、30mg/kg，30min后提取NAc区蛋白，免疫印迹（western blotting）法检测NAc区自噬标志物LC3Ⅱ蛋白水平。单次腹腔注射可卡因（15mg/kg）60min后，电镜、激光共聚焦显微镜观察自噬水平的变化。NAc区注射Atg5 shRNA或自噬激活剂观察小鼠对单次可卡因注射的行为学反应。 结果：单次腹腔注射可卡因（15mg/kg）时间和浓度依赖性地增加Nac区自噬水平，60min时自噬水平增加最明显（138.41±5.44％，n=3-7，p<0.001 vs sal）。电镜和免疫荧光实验发现，可卡因（15mg/kg）明显增加Nac区自噬体。行为学检测发现，激活自噬可抑制可卡因引起的小鼠自发活动增加，运动距离从7425.56±482.13cm降低到5684.02±286.31cm（n=6-10，p<0.05 vs coc），而抑制自噬可进一步增加小鼠对可卡因的反应性，表现为运动距离从6655.83±436.95 cm增加到10933.58±648.94cm（n=6-13，p<0.001 vs coc）。 结论：小鼠单次腹腔注射可卡因诱导伏隔核脑区自噬增加，尤以15mg/kg可卡因注射60min后最为显著。进一步增强自噬有助于降低可卡因诱导的自发活动，表明自噬的激活对可卡因急性暴露可能存在一种保护性作用。 第二部分、单次可卡因暴露激活大鼠伏隔核区细胞自噬的机制 目的：腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）参与机体能量内稳态的调控过程，可间接或直接激活自噬。某些激酶如钙调蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases，CaMs）家族可激活AMPK。有文献报道可卡因增加钙调蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinase Ⅱ，CaMKⅡ）磷酸化水平，那么单次给予可卡因是否通过CaMKⅡ-AMPK这一途径激活自噬呢？ 方法：可卡因孵育野生C57小鼠和AMPKα2敲除鼠脑片，急性分离伏隔核组织，western blotting观察伏隔核区自噬水平的变化。分别给予自噬降解抑制剂、CaMKⅡ拮抗剂、多巴胺受体拮抗剂等孵育大鼠脑片20min后再给予可卡因孵育，western blotting观察伏隔核区LC3Ⅱ、CaMKⅡ、AMPK硫酸化水平的变化。 结果：不同浓度可卡因（1μM、10μM、100μM）孵育脑片20min，自噬水平表现为浓度和时间依赖性的增加，10μM可卡因孵育20min增加LC3Ⅱ水平最为显著（168.26±18.95%，n=3-6，p<0.001 vs sal）。自噬降解抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）不能阻断上述过程，表明可卡因增加自噬水平是通过影响自噬形成过程实现的。10μM可卡因时间依赖性地增加AMPK、CaMKⅡ磷酸化水平，但不影响p-p70S6K水平（n=3）。可卡因孵育AMPKα2敲除鼠脑片则不能诱导自噬，给予CaMKⅡ抑制剂KN93（140mmol）预处理可减少可卡因引起的NAc区LC3Ⅱ（coc：128.51±4.3%，KN93+coc：107.65±5.13%，n=3，p<0.01 vs coc）、CaMKⅡ（coc：141.71±11.38%，KN93+coc：89±5.21%，n=3，p<0.01 vs coc）和AMPK（coc：148.70±9.19%，KN93+coc：117.83±8.36%，n=3，p<0.01vs coc）的激活。给予多巴胺D1受体阻断剂SCH23390（10μM）预处理可取消可卡因引起的NAc区LC3Ⅱ（coc：127.53±5.6%，SCH23390+coc：104.90±3.52%，n=3，p<0.001 vs coc）、CaMKⅡ（coc：134.83±6.41%，SCH23390+coc：104.88±1.03%，n=3-6，p<0.05 vs coc）和AMPK（coc：136.45±7.74%，SCH23390+coc：93.61±7.95%，n=3-8，p<0.05 vs coc）激活，而D2受体阻断剂无此作用。 结论：单次可卡因暴露通过激动NAc区D1受体，继而激活CaMKII来上调AMPK活性，从而诱导自噬水平增加。
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