脑胶质瘤光学和磁共振双报告基因成像系统的构建

摘要

目的：构建脑胶质瘤光学和磁共振成像双报告基因慢病毒系统，在体内外验证目的蛋白的表达，并进一步检测目的蛋白的成像功能。
　　方法：首先构建 FTH-EGFP-GV287慢病毒载体，进行慢病毒包装与生产，转染构建稳定表达铁蛋白重链、绿色荧光蛋白的细胞株F98-FTH-EGFP及仅表达绿色荧光蛋白的细胞株F98-EGFP，体内外验证FTH及其标记蛋白FLAG的表达，细胞及小动物水平验证光学成像的可行性，细胞及小动物水平验证铁蛋白储存铁的功能，验证MRI成像的可行性。
　　结果：将构建的光学和磁共振成像双报告基因慢病毒转染细胞后，通过免疫组化、WB、免疫荧光验证细胞成功的表达了EGFP与FTH。通过荧光显微镜与小动物光学成像仪，验证了体内外光学成像的可行性。但是在进行铁蛋白功能验证时，得到的是阴性结果，通过普鲁士蓝染色、原子吸收法均未检测到转染后细胞内铁的富集，体内外MRI上未检测到局部T2WI信号的下降。
　　讨论：虽然我们通过免疫荧光、免疫组化检测到了铁蛋白重链的过表达，但在铁蛋白储存铁功能验证时，我们得到的是阴性结果，通过阅读文献与相关阳性结果对比，考虑是由于在实验设计时，为了能够更好的、特异性更高的检测到过表达的铁蛋白，我们在铁蛋白重链的C端添加了一个3FLAG片段，这是由25个氨基酸所构成的标签蛋白，具有亲水性，影响了邻近的亚铁氧化酶的活性，使过表达的铁蛋白重链失去氧化亚铁离子的能力，不能储存铁离子。我们后续又构建了一个不带标签蛋白的过表达铁蛋白重链的质粒，用293T初步验证了实验组过表达的铁蛋白重链具有一定的储存铁的功能。

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引言

材料与方法

1. 实验材料

2. 实验方法和与过程

结果

1. 构建的重组质粒GV287-EGFP-FTH图谱

2. 电泳图

3. 阳性克隆测序结果及结果分析

4. Western Blot法

5. 免疫荧光方法检测F98-FTH-EGFP的FTH及其标记蛋白FLAG的表达情况

6. 免疫组化法检测肿瘤组织水平FTH及其标记蛋白FLAG的表达

7. F98、F98-FTH-EGFP、F98-EGFP三种细胞荧光显微镜下成像

8. 从左至右为F98、F98-FTH-EGFP、F98-EGFP三种细胞皮下瘤小动物光学成像

9. 普鲁士蓝染色检测F98-FTH-EGFP、F98-EGFP及F98细胞内铁

10. 普鲁士蓝染色检测F98-FTH-EGFP肿瘤组织细胞内铁

11. 原子吸收分光光度法测定F98-FTH-EGFP、F98-EGFP及F98细胞内铁

12. F98、F98-FTH-EGFP及F98-EGFP三组细胞凝胶的MRI成像

13. 从左至右分别为F98、F98-FTH-EGFP及F98-EGFP三组细胞裸鼠皮下瘤MRI成像

14. 不带标签的过表达铁蛋白重链的质粒图谱

15. 293T 包装细胞初步验证实验组细胞内普鲁士蓝染色见蓝色颗粒散在分布

讨论

参考文献

综述: 干细胞体内示踪成像

附录

致谢