二硫化碳对雄性大鼠睾丸组织氧化损伤和细胞凋亡的影响及环孢素A的干预作用

摘要

目的：二硫化碳（carbon disulfide，CS2）是工业上常用的有机溶剂和化工原料，广泛应用于粘胶纤维生产、玻璃纸制造业和有机溶剂等生产过程中。近年来CS2对男（雄）性生殖系统的影响也被广泛研究，主要表现为性功能障碍、生殖器萎缩、内分泌激素紊乱及精子生成和活力的降低等。但目前关于CS2对男（雄）性生殖损伤作用的研究鲜有报道。本实验选取雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠进行亚慢性吸入染毒，初步探讨 CS2对大鼠一般状况，睾丸组织病理学变化，睾丸功能标志酶，睾丸组织氧化损伤和睾丸生殖细胞凋亡线粒体通路的影响及其可能的分子机制，同时观察环孢素 A（cyclosporin A，CsA）的干预作用。为阐明CS2对男（雄）性生殖损伤的作用提供科学依据。
　　方法：清洁级健康雄性SD大鼠36只并随机分为6组：即空白对照组、3个CS2浓度组（50,250,1250 mg/m3）、CsA干预组〔CS2(1250 mg/m3)+CsA(12.5 mg/kg)〕和CsA对照组（12.5mg/kg）。CS2静式吸入染毒，每天2小时，每周5天，共10周，空白对照组仅吸入新鲜空气。CsA则依据大鼠体重并按12.5mg/kg的比例溶解于牛奶中，在CS2染毒4周后进行灌胃干预，每天1次，每周5天，共6周。观察大鼠一般状况，每周末记录大鼠体重，染毒结束后称量各组大鼠体重，断头处死大鼠，称量睾丸重量；睾丸组织苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察其形态学改变；提取睾丸组织总蛋白，应用分光光度法检测大鼠睾丸组织中丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）和过氧化氢酶（catalase,CAT）活性以及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和γ-谷氨酰胺转肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase,γ-GT）活性，应用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠睾丸组织中8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG）含量，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose6-phosphatedehydrogenase,G-6-PD）和山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase,SDH）活性；原位末端转移酶标记技术（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测大鼠睾丸生殖细胞凋亡情况；蛋白质印迹法（Western Blot）检测大鼠睾丸组织中Cyt C、Bcl-xL、Bad、Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白的相对表达水平。
　　结果：实验结果表明，10周CS2染毒期间，各组大鼠生长状况良好，染毒后期部分大鼠出现毛发枯槁、活动减少、精神萎靡和体型消瘦等症状。CS2染毒对大鼠生长发育无明显影响，随着CS2染毒浓度的增加，HE染色大鼠睾丸组织形态损伤情况不断加剧，CsA干预对大鼠睾丸组织形态有一定缓解。G-6-PD、γ-GT和SDH活性均在低浓度组时显著性上升，明显高于空白对照组（P<0.01，P<0.05）；随后中、高浓度组G-6-PD、γ-GT和SDH活性开始下降，与空白对照组比较差异无统计学意义；CS2染毒组LDH活性与空白对照组比较无明显差异（P>0.05）；CsA干预对睾丸功能标志酶活性无明显影响。抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT活性呈下降趋势（P<0.01，P<0.05），而脂质过氧化分解产物MDA和DNA损伤标志物8-OHdG则有明显上升（P<0.01），CsA干预对大鼠睾丸组织氧化损伤具有一定的保护作用。中、高浓度组的凋亡指数明显高于空白对照组（P<0.05）；CsA干预后，CsA干预组的凋亡指数有明显下降（P<0.05），但仍高于空白对照组（P<0.05）。Western Blot结果显示，CS2染毒组CytC、Bad蛋白含量与空白对照组比较有明显增加（P<0.05），而Procaspase-9、Procaspase-3、PARP和Bcl-xL蛋白含量则有下降的趋势（P<0.05）。CsA干预后，与高浓度组比较，CsA干预组Cyt C蛋白含量明显下降（P<0.05），PARP、Bcl-xL蛋白含量则显著提高（P<0.05）；Procaspase-9、Procaspase-3和Bad蛋白含量均有不同程度的变化，但与高浓度相比差异无统计学意义。
　　结论：一定浓度的CS2对大鼠睾丸组织及其形态有明显的损害作用，干扰睾丸功能标志酶活性，诱导睾丸组织发生氧化损伤并导致细胞凋亡率增加。CS2染毒导致的睾丸组织细胞凋亡率增加与细胞凋亡线粒体通路存在密切联系。CsA作为细胞凋亡抑制剂能够抑制CS2所致的睾丸组织细胞凋亡，这可能与CsA对细胞凋亡线粒体通路相关蛋白表达的调控有关。

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前言

1 材料和方法

1.1 雄性大鼠亚慢性CS2吸入染毒与CsA干预模型

1.2 苏木素-伊红染色

1.3 睾丸功能标志酶活性检测

1.4 脂质过氧化与抗氧化酶活性检测

1.5 DNA氧化损伤标志物（8-OHdG）检测

1.6 原位末端转移酶标记技术（TUNEL法）

1.7 线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平检测（Western Blot）

1.8 统计学方法

2 结果

2.1大鼠的一般状况、体重和脏器系数变化

2.2 CS2对大鼠睾丸组织形态学影响及CsA干预作用

2.3 CS2对大鼠睾丸功能标志酶的影响及CsA干预作用

2.4 CS2对大鼠睾丸组织氧化损伤的影响及CsA干预作用

2.5 CS2对大鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响及CsA干预作用

2.6 CS2对大鼠睾丸生殖细胞线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平的影响及CsA的干预作用

3. 讨论

4. 结论

创新点

参考文献

综述:线粒体通路与细胞凋亡

硕士研究生期间参与的教学、科研和论文发表情况

致谢