中国红豆杉细胞紫杉烷羟化和酰化产物形成规律及其调控

摘要

紫杉醇是一种优良的天然广谱抗癌药物，目前植物细胞培养被认为是工业化生产紫杉醇最有前景的方式，但细胞培养存在着生产的紫杉醇及其制药前体产量低、副产物多等问题。从细胞次生代谢的角度看，二萜类的普遍前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）到紫杉二烯、再到紫杉醇分子，经历了一系列以羟化和随后的酰化为主要官能团的复杂多样的生物合成反应，紫杉醇及可用于制药的前体紫杉烷仅是其中特定的支路代谢产物。现有的研究表明，紫杉烷官能团的形成既受特定的基因控制，又受反应动力学影响，羟化及酰化基因家族呈现网络化调控特征，但这些网络的分布及受控因素仍不十分清楚，因此，无法针对紫杉醇的生物合成进行有效的代谢调控。本研究利用代谢组学方法，结合对红豆杉细胞转录组数据的挖掘，对中国红豆杉细胞内的相关代谢网络进行了分析，旨在阐明中国红豆杉细胞合成紫杉醇及其主要旁路紫杉烷的主要官能团化反应规律，并发现网络中对紫杉醇合成能够有效调控的关键节点或调控环节，为最终利用植物细胞培养技术高效定向合成紫杉醇提供理论和实验依据。
　　本研究主要内容包括：⑴建立了紫杉烷化合物组的代谢轮廓分析方法。利用二氯甲烷、甲醇和水分步提取，更加全面地保留细胞内不同极性的紫杉烷。建立了利用反相苯基柱（Zorbax SB-Phenyl，4.6 mm×250 mm，5μm）为分离柱，以乙腈、水等极性溶剂为流动相进行梯度洗脱，以紫外检测器和质谱检测器共同检测的分析方法，实现细胞内多种微量紫杉烷物质的同时、半定量分析。应用此方法，建立了受试细胞的紫杉烷液相-质谱（LC-MS）数据库。⑵建立了代谢组学与基因转录组分析相结合系统研究细胞代谢网络的方法。使用气相色谱-飞行时间质谱联用（GC-TOF-MS）技术对中国红豆杉细胞内的初生代谢产物及萜类合成关键中间体进行了代谢组学分析，获得了209个胞内代谢物的代谢数据信息；利用液相-电喷雾离子质谱联用（LC-ESI-MS）技术对紫杉烷进行代谢轮廓分析，获得细胞内紫杉烷类次生代谢物的数据信息；利用本团队已经完成的中国红豆杉细胞转录组数据，筛选一组与紫杉醇生物合成相关的羟基化和酰基化基因，利用实时定量-聚合酶链式反应（QRT-PCR）技术对这些基因进行同步分析，获得多个相关基因的代谢数据。利用紫杉烷合成诱导子茉莉酸甲酯（MJ）和溶氧胁迫作为扰动代谢的手段，根据代谢组和基因转录组的数据，进行多变量分析，在此基础上绘制出中国红豆杉细胞连接初生代谢和紫杉烷类次生代谢物质的代谢网络谱图，给出中国红豆杉细胞在溶氧胁迫下不同紫杉烷的代谢规律和调控方向。⑶分析了中国红豆杉细胞内紫杉烷物质羟基和酰基的形成规律。发现MJ诱导后，紫杉醇组紫杉烷（TAX）上升幅度大于多乙酰基紫杉烷（MAT）。同时发现所挑选的20种紫杉醇合成相关羟基化和酰基化的基因转录水平呈现与产物相似的变化趋势。本文还发现，总羟化基因的表达量远高于总酰化基因的表达量，这与TAX的增量高于MAT的增量规律相一致。主成分分析结果表明，羟化基因表达量的增加有助于代谢流流向TAX，未知基因OHX1和ACX3在上调TAX、下调MAT中具有重要作用。⑷分析了溶氧对中国红豆杉细胞代谢流向的影响及其调控方向。利用初生代谢组分析获得的209种胞内初生代谢物及中间体的代谢信息，全面关联细胞内紫杉烷类次生代谢产物及相关的7个羟化基因的QRT-PCR数据。发现低溶氧条件下，羟化基因表达远高于其他两组，并且TAX的增量显著；进一步研究发现，低溶氧条件下，糖酵解途径和丙酮酸无氧途径增强，三羧酸循环减弱，同时通往萜类生物合成的甲羟戊酸途径增强，从丙酮酸到合成细胞色素C的苏氨酸的代谢途径也增强。综合产物及基因的变化规律，可以得出低溶氧条件下萜类合成途径及羟化基因合成与表达水平的增强，是导致TAX合成增强的根本原因。

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1 绪 论

1.1 引言

1.2 紫杉烷提取分离和检测方法研究进展

1.3 紫杉醇生物合成途径及关键基因研究进展

1.4 调控红豆杉细胞内紫杉烷代谢流的研究进展

1.5 本课题的研究意义及主要内容

2 紫杉烷类物质代谢轮廓分析方法及LC-MS数据库的建立

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与讨论

2.4 本章小结

3 基于组学方法研究紫杉烷羟化和酰化产物的形成规律

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 本章小结

4 增强目标紫杉烷代谢流向的调控方式研究

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与讨论

4.4 本章小结

5 总结与展望

5.1 全文总结

5.2 主要创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

附录Ⅰ 攻读学位期间发表论文

附录Ⅱ 主要符号的中英文对照表

附录Ⅲ 26种紫杉烷物质的质谱图

附录Ⅳ 中国红豆杉细胞内209种胞内代谢产物