二穗短柄草BdWRKY2,BdWRKY7和BdWRKY43基因的克隆、表达分析和遗传转化

摘要

非生物逆境胁迫严重危害多种重要粮食作物（如小麦、大麦和燕麦等）的生长和发育，进而严重降低其产量，因此迫切需要分离非生物逆境反应相关基因、并阐明其功能，通过基因工程手段培育抗性作物新品种。二穗短柄草与小麦同属于冷季型早熟禾亚科植物，遗传关系密切，且二穗短柄草Bd21的全基因组的测序工作已经完成，基因克隆方便，是研究小麦功能基因的理想模式植物。转录因子WRKY是植物十大转录调节因子之一，能够调节多种农艺性状，其功能涉及发育、代谢、衰老、生物和非生物逆境胁迫等。因此，二穗短柄草WRKY基因的克隆、表达模式分析以及遗传转化研究有望为麦类作物的遗传改良提供理论支持。
　　本研究克隆了BdWRKY2，BdWRKY7和BdWRKY43基因，并对其进行了生物信息学分析、表达分析、亚细胞定位分析、转化烟草以及初步的表型分析的工作。主要研究结果如下：
　　(1)通过检索二穗短柄草WRKY基因数据库和植物基因组数据库，获得BdWRKY2,BdWRKY7和BdWRKY43基因的cDNA和DNA序列，利用Primer Premier5.0设计目的基因的特异性引物，成功克隆了BdWRKY2/7/43的基因。
　　(2)利用DNAMAN和MEGA5.0对BdWRKY转录因子进行多序列比对和进化分析，结果显示BdWRKY2属于IIc亚家族，BdWRKY7属于I家族，BdWRKY43属于III家族。
　　(3)利用半定量RT-PCR技术分析目的基因BdWRKY2/7/43的器官差异性和在非生物逆境胁迫及分子信号处理下的表达水平。结果表明这3个基因在幼叶中的表达量都比较高，且均响应多种非生物胁迫，具体表现为：
　　BdWRKY2基因受PEG,ABA,NaCl,H2O2,heat的诱导，表达上调；BdWRKY7基因受PEG,NaCl,H2O2，heat,cold的诱导，表达上调；BdWRKY43基因受PEG,heat的诱导，表达上调，受ABA,NaCl,H2O2,cold的诱导，表达下调。
　　(4)将已获得的目的基因BdWRKYs构建到pCAMBIA1304表达载体上，获得pCAMBIA1304-BdWRKY植物过表达载体。
　　(5)基因枪介导的洋葱表皮细胞的瞬时表达分析显示，转录因子BdWRKY2，BdWRKY7和BdWRKY43均定位于细胞核。
　　(6)利用叶盘法转化烟草，成功获得了13株转BdWRKY2、8株转BdWRKY7和12株转BdWRKY43基因的烟草株系。同时，利用半定量RT-PCR技术进一步分析了部分BdWRKY2/7/43基因过表达烟草株系的转录水平。
　　(7)分析了不同转Bd WRK Y7基因株系后代在干旱胁迫下的表型，发现过表达BdWRKY7基因降低了转基因烟草对干旱胁迫的耐受性。
　　本研究成功克隆了BdW RK Y2/7/43基因，并转化了烟草，进而分析了部分转基因株系外源基因的转录水平；另外，还分析了BdWRKY2/7/43基因在非生物胁迫及信号分子处理下的表达模式，并分析了不同转BdWRKY7基因株系后代在干旱胁迫下的表型，为后续WRKY基因响应非生物逆境胁迫的功能阐明乃至抗性农作物新品种的培育奠定基础。

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1 绪论

1. 1 研究背景

1. 2 二穗短柄草的概述

1.3 WRKY转录因子的概述

1.4 二穗短柄草及BdWRKY转录因子的研究现状

1. 5 本文的研究目的和意义

1. 6 本文的技术路线

2 二穗短柄草WRKY基因的克隆

2. 1 仪器与材料

2. 2 实验方法

2. 3 结果与分析

2. 4 小结

3 BdWRKYs基因的生物信息学分析

3. 1 所用数据库和软件

3. 2 结果与分析

3. 3 小结

4 BdWRKYs基因的表达分析

4. 1 仪器与材料

4. 2 实验方法

4. 3 结果与分析

4. 4 小结

5 BdWRKYs基因植物过表达载体的构建

5. 1 仪器与材料

5. 2 实验方法

5. 3 结果与分析

5. 4 小结

6 BdWRKYs蛋白质的亚细胞定位分析

6. 1 仪器与材料

6. 2 实验方法

6. 3 结果与分析

6. 4 小结

7 BdWRKYs基因对烟草的遗传转化

7. 1 仪器与材料

7. 2 实验方法

7. 3 结果与分析

7. 4 小结

8 总结与展望

8. 1 总结

8. 2 展望

本文主要的创新点

致谢

参考文献

附录 攻读硕士学位期间发表的论文情况