小麦TaWRKY9基因的原核表达及多克隆抗体制备

摘要

小麦是人类必不可少的粮食作物之一。干旱、低温、高盐等非生物胁迫和微生物致病体、昆虫进食等生物胁迫严重影响了小麦的生长发育和产量，因此，提高小麦对生物胁迫和非生物胁迫的抗性具有非常现实的意义。在恶劣的外界环境下，植物的生理生化过程会发生一些改变，其中WRKY转录因子起到了重要的调控作用。它不但参与植物生长发育和新陈代谢过程，而且还参与了植物应对外界生物以及非生物的胁迫反应。小麦WRKY转录因子可调控抗病相关基因、损伤诱导基因和衰老相关基因的表达。因此，研究WRKY基因可为抗性小麦育种提供理论基础。
　　在先前的研究中，已经得到了在DNA水平和RNA水平上鉴定为阳性的TaWRKY9转基因烟草植株，但还未在蛋白质水平上得到鉴定。本课题首先培育中国春小麦（Triticum aestivum. L cv. Chinese Spring）幼苗，提取小麦RNA，反转录成cDNA后设计合适的引物、PCR反应体系和程序克隆得到TaWRKY9基因，测序正确后将TaWRKY9基因与表达载体pET32a相连，构建原核表达载体，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达，通过摸索OD600值、IPTG终浓度、温度等几个条件，成功诱导出分子量为67.93 kDa的目的蛋白，然后进行可溶性检测发现目的蛋白为包涵体蛋白，用含有尿素的变性A溶液将目的蛋白成功提取，最后通过胶回收将目的蛋白进行纯化后浓缩到一定浓度，即可作为抗原送到武汉病毒所免疫新西兰兔得到多克隆抗体，最终用制备的抗体进行Western-blot检测证明该抗体可以在蛋白质水平上验证TaWRKY9转基因烟草植株，从而为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础，也能够为研究转基因小麦的抗逆功能提供依据。

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1 绪 论

1.1 WRKY转录因子的起源与进化

1.2 WRKY转录因子的结构特点及分类

1.3 WRKY转录因子的生物学功能

1.4 WRKY转录因子的作用机制

1.5 研究目的与意义

1.6 技术路线

2 实验器材

2.1 实验仪器

2.2 实验材料及来源

2.3 实验试剂

2.4 培养基

2.5 溶液及缓冲液

3 实验方法

3.1 小麦RNA提取以及cDNA制备

3.2 TaWRKY9基因的克隆及鉴定

3.3 构建原核表达载体

3.4 重组TaWRKY9蛋白的诱导表达

3.5 重组TaWRKY9蛋白的提取

3.6 重组TaWRKY9蛋白的纯化

3.7 重组TaWRKY9蛋白的浓度测定

3.8 TaWRKY9蛋白的多克隆抗体制备

3.9 转基因烟草叶片总蛋白的提取

3.10 Western-blot检测

4 实验结果

4.1 小麦RNA提取及cDNA制备

4.2 基因的克隆

4.3 原核表达载体构建

4.4 重组TaWRKY9蛋白的原核表达

4.5 重组TaWRKY9蛋白的提取

4.6 重组TaWRKY9蛋白的纯化

4.7 重组TaWRKY9蛋白浓度的测定

4.8 转基因烟草叶片总蛋白的提取

4.9 Western-blot检测

5 讨 论

5.1 原核表达与真核表达

5.2 目的蛋白的纯化：胶回收与镍柱亲和层析

5.3 Western-blot检测的结果：目的蛋白分子量与软件预测的不一致

致谢

参考文献

附录1 pET-32a(+)质粒图谱

附录2 攻读学位期间发表的论文情况