利用基因组编辑技术TALENs研究急性白血病DNMT3A突变的分子机制

摘要

成人急性淋巴细胞白血病DNMT3A基因突变研究
　　目的:本研究旨在探讨成人急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者中DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferase，DNMT3A）突变发生的频率、与其他临床特征间的相关性以及对患者预后的影响。
　　方法:收集57例急性淋巴细胞白血病患者的骨髓或外周血细胞，使用Ficoll梯度离心法分离单个核细胞，提取基因组DNA后采用PCR的方法对DNMT3A热点突变所在的第23号外显子进行扩增，PCR产物纯化后测序，与正常基因组序列比对筛查突变结果。通过本科室生物标本库获取57例患者相关临床特征信息并进行统计分析。
　　结果:在57例ALL患者中，共检测出3例（5.3％）携带DNMT3A R882H突变。T-ALL患者中突变的发生率明显高于B-ALL患者（P=0.048）。年龄在40至60岁之间的患者与其他年龄组相比具有更高的突变发生率（P=0.042）。在全部患者中和T-ALL中，携带DNMT3A突变的患者与野生型患者相比整体生存期较短（P=0.02和P=0.014）。
　　结论： DNMT3A突变在 ALL中发生率较低，突变患者其整体生存期明显缩短，提示该突变对成人ALL患者的危险分级和治疗具有重要的意义。
　　392例成人急性髓系白血病DNMT3A基因突变研究
　　目的:本研究旨在研究成人急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者中DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferase，DNMT3A）突变发生的频率、与其他临床特征间的相关性以及对患者预后的影响。
　　方法:收集392例成人急性髓系白血病患者的骨髓或外周血细胞，使用Ficoll梯度离心法从中获取单个核细胞，提取基因组DNA后采用PCR的方法对DNMT3A热点突变所在的第23号外显子进行扩增，PCR产物纯化之后测序，最后与正常基因组序列比对判读突变结果。通过本科室生物标本库获取392例患者相关临床特征信息并进行统计分析。
　　结果:在392例AML患者中，共检测出37例（9.44%）携带DNMT3A R882突变，其中DNMT3A R882H29例（78.38%），R882C8例（21.62%）。DNMT3A突变阳性患者与野生型患者相比，年龄明显偏大，但在性别、白细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数和初诊时原始细胞比例等方面无明显差异。DNMT3A突变主要集中于M4和M5中，与NPM1突变和FLT3-ITD突变之间存在明显正相关性（P<0.001）。在染色体核型分析中，DNMT3A突变主要集中在 CN-AML中（83.78%，31/37，P<0.001）以及中危组中（91.89%，34/37，P<0.001）。生存分析显示，在整体 AML和CN-AML患者中，DNMT3A突变阳性患者和野生型患者相比，OS（P=0.0218和P=0.0006）和EFS（P=0.0203和P=0.0006）均明显缩短。在CN-AML中，多因素分析结果显示DNMT3A突变可以作为一个独立的预后因素，提示较短的整体生存期（HR=1.986,95%CI1.207 to3.269，P=0.007）。
　　结论：DNMT3A突变在AML中发生频率较高，并且对患者预后具有不良影响，提示该突变对成人AML患者预后危险分级和治疗方案的选择具有重要的意义。
　　利用基因组编辑技术TALENs研究急性白血病DNMT3A突变的分子机制
　　目的：我们研究的目的在于利用TALENs技术构建一株携带 DNMT3A突变的 K562细胞系，并研究该突变对肿瘤细胞生物学效应的影响。
　　方法:设计并使用快速模块组装法构建 DNMT3A-TALEN质粒。TALEN质粒和供者质粒一起电转入K562细胞，之后用PCR的方法筛选携带DNMT3A R882H突变的克隆。用全外显子测序的方法检测DNMT3A-TALEN质粒可能存在的脱靶效应。蛋白质印迹技术检测DNMT3A和SLC7A11基因蛋白水平的表达变化。克隆形成试验和CFSE实验检测突变克隆的增殖能力。用流式细胞术检测细胞凋亡率。
　　结果:本研究中，我们首次使用TALENs技术成功构建了一株携带DNMT3A R882H突变的K562细胞系。克隆形成试验和CFSE实验证实该突变可以明显促进细胞的增殖。表达谱芯片结果显示一些与GSH合成相关的关键基因表达明显升高，包括CTH，PSPH，PSAT1特别是 SLC7A11（胱氨酸/谷氨酸转运体），从而导致突变克隆细胞内GSH含量升高。此外，检测细胞凋亡率结果显示突变克隆出现化疗抵抗，联合使用SSZ（柳氮磺胺吡啶）可以提高对化疗药物的敏感性。
　　结论：本研究结果为DNMT3A R882H突变在AML发病机制中的作用提供了新的见解，DNMT3A R882H突变克隆细胞内 GSH含量升高，出现化疗抵抗，联合使用SLC7A11的抑制剂SSZ可提高化疗药物敏感性，为携带DNMT3A R882H突变AML患者提供了新的诊疗思路。

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华中科技大学博士学位论文创新点概述

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第一部分

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述: 基因组编辑工具酶概述

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附录2博士期间发表文章

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