小麦转录因子TaWRKY1和TaWRKY44基因在非生物胁迫中的功能研究

摘要

植物作为固着生物，其生长发育常常受到各种生物和非生逆境物胁迫的影响。随着全球局部环境恶化，由强光、紫外线照射、极端温度、干旱、盐碱度等非生物胁迫引起的作物品质和产量下降的问题日趋严重。其中干旱、高盐和低温是三种最主要的影响植物生长发育的非生逆境物胁迫。小麦是最重要的粮食作物之一，分离鉴定小麦抗逆相关基因并阐明其作用机制，对于小麦抗逆性遗传改良具有重要意义。
　　WRKY是植物特有的一类转录因子家族，通过与逆境相关基因上游启动子中的顺式作用元件相互作用广泛参与植物抵御生物与非生物胁迫的过程。近年来，有关WRKY转录因子在植物生长发育、衰老以及抗逆性方面的研究报道越来越多，然而，有关WRKY转录因子在重要粮食作物小麦中抵御非生物逆境胁迫过程中扮演的角色还知之甚少，特别是其内在分子机制有待进一步阐明。
　　本研究从中国春小麦中成功克隆了10个之前未见报道的TaWRKY基因的cDNA序列，并对这10个基因在小麦中的逆境及激素处理应答模式进行了分析，在此基础上对TaWRKY1与TaWRKY44基因的抗逆功能进行了较为深入的研究，其主要研究结果如下：
　　1） TaWRKY44-TaWRKY53的基因克隆以及在小麦中的表达分析
　　通过检索DFCI、NCBI与EnsemblPlants数据库中的小麦EST序列，成功拼接并利用RT-PCR技术克隆得到了之前未见报道的10个小麦WRKY基因，并将这10个基因分别命名为TaWRKY44-TaWRKY53。其编码氨基酸序列比对分析表明，这些转录因子可以分为三大类，其中 TaWRKY44和 TaWRKY45属于 I类，TaWRKY48、TaWRKY51、TaWRKY52和 TaWRKY53属于 II类，TaWRKY47、TaWRKY49和TaWRKY50属于III类。另外由于未获得TaWRKY46的C末端序列，推测其可能属于I类或II类。利用半定量RT-PCR技术分析了TaWRKY44-TaWRKY53基因在各种逆境和激素处理下的表达情况。发现这10个TaWRKY基因在植物中能够响应多种非生物胁迫，其响应逆境胁迫与激素处理的模式也都不尽相同，推测这些差异与不同WRKY基因在参与不同的逆境反应过程发挥不同作用有关。
　　2）TaWRKY1和TaWRKY44的表达分析
　　进一步利用荧光定量RT-PCR技术，详细分析了TaWRKY1和TaWRKY44在不同器官与不同逆境和激素处理下的表达情况，结果表明，TaWRKY1基因和TaWRKY44基因在根和叶中有较高的表达，而在茎和雄蕊、雌蕊中表达量较低；TaWRKY1的表达显著受到PEG6000，低温（4℃），脱落酸（ABA）和双氧水（H2O2）处理的诱导，而TaWRKY44的表达显著受到PEG6000，4℃，NaCl、ABA、GA和H2O2处理的诱导。推测TaWRKY1基因和TaWRKY44基因通过参与不同的信号通路参与不同的非生物胁迫反应。
　　3） TaWRKY1和TaWRKY44的亚细胞定位分析
　　构建了 TaWRKY1和 TaWRKY44与 GFP融合蛋白表达载体pCAMBIA1304-TaWRKY1-GFP和 pBI121-TaWRKY44-GFP，洋葱表皮瞬时表达结果表明，二者的荧光信号均定位在细胞核中，而对照载体的GFP蛋白则没有明显的细胞局部定位。这与推测的其转录因子功能是一致的。
　　4）TaWRKY1和TaWRKY44转录活性分析
　　转录激活分析表明，TaWRKY1的C端具有较强的激活活性，但其的全长转录激活活性却被其N端第28位至38位氨基酸序列中富含L的LRSLELLVSSL序列所抑制；而TaWRKY44的N端具有较强的激活活性，但其全长却缺乏转录激活活性，推测其 N端序列外拥有抑制转录激活活性的序列存在。酵母单杂交分析结果表明，TaWRKY1能够结合DNA核心序列TTGACC和TTGGCC，而TaWRKY44能够结合DNA核心序列TTGACC和TTAACC。
　　5) TaWRKY1和TaWRKY44在转基因烟草中的功能分析
　　在烟草中组成型表达TaWRKY1能够显著增强转基因烟草对干旱胁迫和渗透胁迫的耐受能力；同样，在转 TaWRKY44基因的转基因烟草能赋予植物抵御干旱、盐以及渗透胁迫的耐受能力。这些表型在相对水含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、离子渗漏率等生理指标数据上都得到了印证。超氧化物歧化酶、过氧化物酶以及过氧化氢酶活力和双氧水含量等分析结果暗示，转基因烟草抗逆性可能是由于植物的抗氧化酶活系统被激活从而避免受到氧化损伤而获得的。同时，植物抵御逆境胁迫相关基因与活性氧胁迫相关基因的表达分析表明，在转基因植株中一系列不同的抵御逆境及活性氧胁迫相关基因的表达量发生明显的上调表达，这也与之前的各项生理、酶活指标相互印证。综上所述，推测TaWRKY1和TaWRKY44是通过直接或间接的影响转基因植物的抗氧化酶活系统及调控逆境胁迫相关基因的表达赋予植物抵御这些非生物逆境的能力。

目录

声明

第一章 前言

1.1 植物与非生物逆境胁迫

1.2 WRKY转录因子的结构与来源

1.3 WRKY转录因子的功能研究进展

1.4本研究的研究策略

1.5本研究的技术路线

1.6本研究的研究内容

1.7本研究的研究目的和意义

第二章小麦WRKY基因的拼接、克隆与表达分析

2.1 实验材料

2.2 实验器材

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

2.6 本章总结

第三章 小麦TaWRKY1和TaWRKY44转录因子的亚细胞定位及转录活性分析

3.1 实验材料

3.2 实验器材

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

3.6 本章小结

第四章 转TaWRKY1烟草植株对干旱和渗透胁迫的耐受性分析

4.1 实验材料

4.2 实验器材

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6 本章小结

第五章 转TaWRKY44烟草植株对多重非生物胁迫耐受性分析

5.1 实验材料

5.2 实验器材

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 讨论

5.6 本章小结

第六章 总结与展望

6.1 总结

6.2 展望

本研究的主要创新点

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表的论文情况

附录2 主要符号与缩略词表