TGF-β1通过PP2Ac调控的Raf-MEK-ERK通路诱导内皮细胞谷氨酰胺分解

摘要

目的：探讨在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的内皮细胞病理生理改变中谷氨酰胺分解变化及可能存在的分子调节机制。
　　方法：以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究对象，TGF-β1（10ng/ml）刺激内皮细胞48h，western blot法检测谷氨酰胺分解中的关键酶-肾型谷氨酰胺酶（KGA）的蛋白表达，用谷氨酸/谷氨酸氧化酶检测试剂盒检测细胞内谷氨酸含量的改变。同时western blot法检测不同时间点下p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf、p-ERK1/2、T-ERK1/2和蛋白磷酸酶2Ac（PP2Ac）的表达，用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性试剂盒来检测蛋白磷酸酶2A（PP2A）的活性。用MEK1/2特异性活性抑制剂U0126（10μM）预处理细胞30min，western blot法检测在TGF-β1刺激内皮细胞15min或60min时KGA的表达。最后用PP2A特异性活性抑制剂OA或小分子干扰RNA（PP2Ac siRNA）转染细胞的方法特异性的抑制PP2A的活性，western blot法检测在TGF-β1刺激内皮细胞15min或60min时p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf、p-ERK1/2和T-ERK1/2蛋白表达。
　　结果：在TGF-β1的刺激下，内皮细胞中KGA蛋白表达和细胞内谷氨酸含量都明显升高，短时间内（90min）p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf和p-ERK1/2蛋白表达增多，而在总c-Raf蛋白中p-c-Raf(Ser259)蛋白比例下降；PP2A在蛋白水平表达无明显改变但磷酸酶的活性从15min开始增强，60min时达到峰值。在15min和60min时与模型组（TGF-β1）相比，抑制剂干预组（TGF-β1+U0126）的KGA蛋白表达下调（P﹤0.05）。用化学抑制剂OA或siRNA转染的方法抑制PP2A的活性时，p-c-Raf(Ser259)、T-c-Raf和p-ERK1/2蛋白表达减少，在总c-Raf蛋白中p-c-Raf(Ser259)蛋白比例升高（P﹤0.05）。
　　结论：在人脐静脉内皮细胞中，TGF-β1促使谷氨酰胺分解代谢增强；催化谷氨酰胺分解的关键酶-KGA的表达受PP2A正性调控的Raf-MEK-ERK信号通路的调节作用。

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前言

材料和方法

1 主要仪器和材料

2 主要试剂

3 主要试剂的配置

4 主要实验方法

5 统计学分析

结果

2.在内皮细胞中，c-Raf-MEK-ERK信号通路活化参与调控KGA蛋白表达

3.在内皮细胞中TGF-β1诱导了PP2A的活化，而PP2Ac的蛋白表达没有发生变化

4.OA抑制TGF-β1介导的Raf-MEK-ERK信号通路的活化

5.用PP2Ac siRNA短时间内敲除PP2Ac蛋白抑制TGF-β1诱导的Raf-MEK-ERK信号通路的激活

讨论

参考文献

综述： 谷氨酰胺分解代谢的研究现状

致谢