肿瘤相关成纤维细胞分泌外泌体增强肿瘤细胞放疗抵抗及机制研究

摘要

目的：结直肠癌(CRC)患者放射治疗中存在放疗抵抗的原因可能是因为肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）的存在，但CSCs引起放疗抵抗的机制目前并不十分清楚。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)可以调节肿瘤细胞的“干性”和肿瘤的放疗敏感性。研究报道外泌体(Exosomes)可通过细胞-细胞之间的“交流”来调节细胞对治疗的反应。本研究旨在探索CAFs分泌的exosomes是否能够调节结直肠癌的放疗抵抗并探寻进一步机制。
　　方法：我们依据CSCs表面标志CD133从结直肠癌细胞系SW620中分离CSCs。然后我们测定CSCs对放疗敏感性。我们分别将CAFs的条件培养基(CAFs-CM)和其所分泌的exosomes(CAFs-exosomes)作用于SW620细胞，然在细胞和动物水平分别检测SW620细胞的放疗敏感性变化情况。
　　结果：CSCs对放疗表现出天然的抵抗。CAFs-CM促进了SW620细胞的细胞球体的形成。在细胞和动物实验中，CAFs-CM均能增强SW620对放疗的抵抗。进一步实验表明，CAFs-exosomes也表现出相似的上述效果，而且去除exosomes的CM不能促进SW620细胞细胞球体的形成，也没有表现出增强SW620细胞放疗抵抗的能力。
　　结论：CAFs促进了结直肠癌细胞的“干性”，并通过这个效应增加了其放疗抵抗。CAFs分泌的exosomes在其中发挥了关键性的作用。

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前言

材料和方法

1.实验仪器

2.主要试剂和材料

3.试剂和材料准备

4.实验步骤

4.1 SW620细胞培养：

4.2 SW620细胞流式分选：

4.3 有限稀释实验：

4.4 连续细胞球体形成实验：

4.5 细胞凋亡流式细胞术分析

4.6 流式检测放疗前后CD133表达：

4.7 放疗前后细胞球体形成能力：

4.8 条件培养基（CM）的制备：

4.9 CM处理前后细胞球体形成能力：

4.10 CM对放疗敏感性调节的小鼠体内实验：

4.11 外泌体(Exosomes)提取：

4.12 Exosomes电镜检查：

4.13 外泌体West Blot分析：

4.14 SW620细胞摄取exosomes实验：

4.15 Exosomes处理前后细胞球体形成能力：

4.16 CM对放疗敏感性调节的小鼠体内实验：

5．统计学分析

结果

1.结直肠癌细胞系SW620中依据CD133的表达分离CSCs并进行鉴定

1.1 SW620细胞中CSCs的分离

1.2 分离的CD133+和CD133-/lo细胞小鼠体内成瘤能力

1.3 分离的CD133+和CD133-/lo细胞体外连续球体形成能力

2.CSCs对放疗的敏感性

2.1 流式细胞术检查CSCs和Non-CSCs对放疗的敏感性

2.2 流式细胞术检测放疗对SW620细胞干细胞比例的影响

3.CAFs-CM通过促进细胞“干性”增强放疗抵抗

3.1 CAFs-CM对SW620细胞球体形成能力的影响

3.2 体外检测CAFs-CM对SW620细胞放疗敏感性的影响

3.3 体内检测CAFs-CM对SW620细胞放疗敏感性的影响

4.CAFs分泌exosomes促进了肿瘤细胞的“干性”和放射抵抗

4.1纯化的exosomes鉴定和摄取

4.2 CAFs-exosomes对SW620细胞球体形成能力的影响

4.3 体外检测CAFs-exosomes对SW620细胞放疗敏感性的影响

4.4 体内检测CAFs-exosomes对SW620细胞放疗敏感性的影响

讨论

参考文献

综述：CSC放射治疗抵抗机制研究进展

致谢