MicroRNA-630在肝细胞癌中通过TGF-β-miR-630-Slug信号通路调控肿瘤转移及其作用机制的研究

摘要

第一部分：MiR-630在肝细胞癌组织中的表达与肝癌病人预后的关系
　　目的：以97例肝细胞癌组织标本为基础，结合病人的临床资料和预后随访资料，研究miR-630在肝癌组织中的表达情况，探讨miR-630的表达与肝癌病人临床病理参数及手术预后的关系。
　　方法：连续选取2010年1月至2012年12月间在华中科技大学附属同济医院肝脏外科中心手术切除的肝细胞癌组织97例，全部标本均经过病理科组织学确诊，结合肝癌病人临床病理参数及预后随访进行分析。
　　结果：结合临床资料显示：miR-630的表达与肝癌转移，包膜完整性，肿瘤的分化程度（Edmonson分级），肿瘤的TNM分期，肿瘤的BCLC分期分级相关。将97例肝癌组织表达miR-630从高到低排序，以中位数为界，高于中位数的归为高表达组，反之归为低表达组。结合随访资料分析显示，miR-630表达水平相对高的病人较之表达水平相对低的病人具有更低的复发率和更长的总体生存时间。四个表卡方检验显示：miR-630的表达与AFP水平，肿瘤数目，血管侵袭，Edmonson分级，BCLC分期呈负相关。单因素分析显示：miR-630的表达水平的降低是一个评估肝癌病人手术切除治疗后复发和生存时间的一个显著而独立的危险因素。
　　结论： miR-630相对高表达的肝癌病人提示可能具有较低的转移概率和较好的预后。
　　第二部分：MiR-630在肝细胞癌中发挥抑制侵袭，转移的作用
　　目的：这部分以中等转移潜能的肝癌细胞系为研究工具，通过转染miR-630的模拟物mimics或者miR-630的抑制物来研究miR-630对肝细胞癌生物学行为的影响。
　　方法：瞬时转染mimics或inhibitors，在转染后的5天内进行细胞功能学实验。如：用CCK-8实验，探讨miR-630对细胞增值能力的影响；用Transwell实验，细胞划痕实验，探讨miR-630对细胞迁移或者侵袭能力的影响；用免疫荧光实验，探讨miR-630对细胞形态及上皮间质样转化的影响。以慢病毒为工具构建稳定的miR-630敲减的细胞系，用裸鼠皮下成瘤模型，在动物实验中探讨miR-630对肝癌致瘤性的影响；用裸鼠肝脏原位种植模型，探讨miR-630对肝癌转移的影响。
　　结果：在中等转移潜能的细胞中，无论是转染miR-630 mimics还是inhibitors细胞的增值能力都没有发生改变。转染miR-630 mimics的细胞，迁移，侵袭能力都减弱，细胞形态更上皮化；而转染了 inhibitors的细胞迁移，侵袭能力都增强，细胞发生了间质样的改变。在动物实验中，细胞稳定敲减miR-630并没有改变肝癌细胞系的致瘤能力；然而却增强了肝癌细胞系肝内转移及肺转移的能力。
　　结论：miR-630能抑制肝癌细胞的迁移，侵袭，上皮间质样转化以及转移，而对增值能力没有影响。
　　第三部分：miR-630在肝癌中通过抑制Slug调控肝癌生物学行为
　　目的：探讨 miR-630在肝癌中通过抑制何种可能的癌基因调控肝癌恶性生物学行为的。
　　方法：用生物信息库预测miR-630的靶基因；荧光素酶报告基因转录分析，免疫组化，Western blotting，RT-PCR检测Slug是否为miR-630的靶基因。用Transwell,划痕，细胞免疫荧光实验，Western blotting，RT-PCR在功能学角度验证miR-630通过靶向抑制Slug从而抑制肝细胞癌的迁移，侵袭，上皮间质样转化。
　　结果：荧光素酶报告基因转录分析显示miR-630能结合Slug mRNA3’ UTR端；免疫组化相关性分析显示肝癌组织中miR-630的表达与Slug呈负相关；Western blotting，RT-PCR检测显示miR-630能抑制Slug的表达，以及抑制上皮间质样转化相关的间质样标记物；Transwell，划痕实验显示抑制Slug能逆转miR-630 inhibitors导致的迁移，侵袭能力增强；细胞免疫荧光实验，Western blotting，RT-PCR检测显示抑制Slug能逆转miR-630 inhibitors导致的上皮间质样转化相关的标记物表达改变。
　　结论：miR-630在肝细胞癌中通过靶向抑制Slug调控其迁移，侵袭，上皮间质样转化。
　　第四部分：在肝癌细胞中TGF-β通过Erk/SP1，JNK/c-jun信号通路抑制miR-630表达
　　目的：研究调控miR-630的上游信号通路
　　方法：利用 RT-PCR检测 TGF-β对 miR-630表达的影响；用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) and Jaspar(http://jaspar.genereg.net/)数据库预测可能的抑制 miR-630转录的结合位点；用荧光素酶报告基因转录分析判断调控miR-630转录的核心序列；用染色质免疫共沉淀法（CHIP）验证SP1, c-jun与相应转录结合位点结合；用荧光素酶报告基因转录分析探讨该核心序列是否能调控miR-630转录；用RT-PCR验证SP1, c-jun在miR-630表达过程中发挥的作用；用Western blot探讨SP1, c-jun能否间接上调miR-630的靶基因Slug。从功能学回复实验角度验证TGF-β是抑制miR-630表达的上游调控因子。如：用Transwell实验，划痕实验，验证miR-630逆转TGF-β刺激导致的细胞迁移，侵袭能力增强；细胞免疫荧光实验，Western blot，RT-PCR实验，验证miR-630逆转TGF-β刺激导致的上皮间质样转化。
　　结果：用浓度为5ng/ml TGF-β培养基处理 Bel7402，HL，PT-PCR检测示 miR-630表达在24小时内呈时间依赖性降低；用TGF-βSmad，non-Smad信号通路抑制剂配合TGF-β联合处理细胞，RT-PCR结果检测示Erk，JNK，P38信号通路抑制剂可上调miR-630表达；NCBI和Jaspar数据库预测显示miR-630转录起始位点上游1kb碱基序列包含多个 Erk，JNK，P38信号通路下游细胞因子结合位点；荧光素酶报告基因转录分析检测示miR-630转录起始位点上游79bp为调控miR-630转录的重要序列；染色质免疫共沉淀法（CHIP）验证结果示：该79bp可结合SP1，c-jun，其分别为Erk，JNK信号通路下游细胞因子；荧光素酶报告基因转录分析再次验证该79bp为为调控miR-630转录的重要序列，并且SP1，c-jun结合位点为阻遏蛋白结合序列；RT-PCR结果示：SP1，c-jun在TGF-β下调miR-630表达中起重要作用；Western blot结果证明抑制SP1，c-jun，能部分逆转TGF-β诱导的Slug表达上调； Transwell，划痕实验显示抑制miR-630 mimics能逆转TGF-β导致的迁移，侵袭能力增强；细胞免疫荧光实验，Western blotting，RT-PCR检测显示抑制miR-630 mimics能逆转TGF-β导致的上皮间质样转化及相关的标记物表达改变。
　　结论：TGF-β通过激活其下游的Erk/SP1，JNK/c-jun信号通路抑制 miR-630表达，从而调控肝癌细胞的生物学行为。

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封面

声明

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前言

参考文献

第一部分：MiR-630在肝细胞癌组织中的表达与肝癌病人预后的关系

摘要

Abstract

1.引言

2. 材料和方法

3. 结果

参考文献

第二部分：MiR-630在肝细胞癌中发挥抑制侵袭，转移的作用

摘要

Abstract

1.引言

2. 材料和方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

第三部分：miR-630在肝癌中通过抑制Slug调控肝癌生物学行为

摘要

Abstract

1. 引言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

参考文献

第四部分：在肝癌细胞中TGF-β通过Erk/SP1，JNK/c-jun信号通路抑制miR-630表达

摘要

Abstract

1. 引言

2. 材料与方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第五部分 综述：MicroRNA 在肝癌发生，发展过程中的研究进展

附录一英文缩略词表

附录二攻读博士研究生期间发表论文情况

致谢