人精浆中睾丸来源环状RNA的存在及特点研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述:
　　第一部分:人睾丸组织中环状RNA的测序与鉴定
　　背景及目的：非编码RNA作为表观遗传调控的重要执行者之一，成为了基因表达转录及转录后水平重要的调控因素。circRNA作为一类新发现的非编码RNA成为了近期转录物组研究的明星分子之一。基因表达及其表观遗传调控在精子发生中起到了至关重要的作用，其异常可能与不育及后代健康紧密相关。本部分我们对人睾丸组织中这一类新型内源性非编码RNA进行了初步的探索，为完善人睾丸组织非编码RNA种类，及研究其在精子发生中的可能作用及机制提供依据与基础。
　　方法：Trizol法提取精子发生正常人睾丸组织总RNA，去除核糖体RNA，使用RNaseR消化所有线性RNA后，构建cDNA文库，采用Illumina HiSeq3000测序平台，PE150测序模式进行高通量深度测序。测序结果中选取表达丰富（count值）不一、长度大小各异的 circRNA，根据所预测的序列起始位点及成环特点，使用 NCBI/Primer-BLAST在线设计Divergent Primer进行qRT-PCR验证及circRNA可变环化（alternative circularization）特性分析。使用RNaseR消化处理睾丸组织RNA，qRT-PCR检测基因对应的circRNA及mRNA在消化前后表达量变化。
　　结果：在人睾丸组织中测序reads的 count值大于等于1的circRNA共计15996条，其中10792条为数据库circBase至目前未收录的，为本次测序中新预测的circRNA。产生这15996条circRNA的宿主基因中，94.6％只能产生6个及6个以内的circRNA。有1017个宿主基因是本次测序中发现可以成环的，且主要与精子发生、精子结构及精子功能等密切相关。同时构成这15996条circRNA的序列70.6%为基因组中外显子序列。随机选取的55个circRNA中，有22个是数据库circBase中存在的circRNA，33个是本次测序预测的新circRNA。其中有30个能特异性的被扩增检测，包括19个数据库circBase中存在的circRNA和11个本次测序中新预测的circRNA；有9个能被扩增检测但同时含有其他bp大小的条带非特异性扩增，包括3个数据库circBase中存在的circRNA和6个本次测序中新预测的circRNA。而成功特异性验证的30个circRNA包含了11个普遍表达基因的16个circRNA和11个睾丸特异性基因的14个circRNA。
　　选取其中3个基因(STK31、RNF17、SAE1)所对应的circRNA设计引物，成功的分析了环状RNA可变环化特性。对9个基因所对应的circRNA及mRNA进行RNase R消化处理后，同一个基因的mRNA表达量显著性降低，而circRNA表达量未见明显降低，反而个别基因（如HIST1H2BA、WDR26、TBL1XR1）的circRNA表达量显著上调约4倍，显示了circRNA高效的耐RNase R消化特性。
　　结论：本研究在人睾丸组织中成功的预测和鉴定了circRNA的存在，新发现了10000多条circRNA及1000多个可以成环的宿主基因。且这些睾丸来源的circRNA具有可变环化特性及耐RNase R消化特性。这些circRNA有望成为新的男性精子发生表观遗传研究点。
　　第二部分:人睾丸来源环状RNA在精浆中的表达与特征
　　背景及目的：精浆中存在丰富的游离mRNA及游离miRNA，稳定性好，获取方便，能全面代表各生殖器官组织（睾丸、附睾、精囊腺、前列腺等）的基因表达信息，是潜在的男性生殖疾病无创性新分子诊断标记物，也是很好的生殖遗传表观遗传研究指标。对于新近报道的circRNA，本部分实验以第一部分已经验证在人睾丸组织中表达的circRNA为研究对象，分析其在精浆中的表达情况及基本特征，从而探索精浆游离circRNA可能的研究前景。
　　方法：收集精液参数正常男性的精液标本，分离精浆，提取RNA，qRT-PCR分析第一部分成功验证的circRNA是否在精浆中表达。将精浆在室温条件下放置0h、12h、24h后，检测circRNA的表达量变化，探索精浆中circRNA的稳定性。将孔径0.1um滤膜过滤与30kDa超滤离心柱超滤相结合，对未处理精浆、滤膜过滤后的滤液及滤膜洗脱液、上述滤膜过滤液再经30kDa超率离心柱离心过滤的滤液及超滤膜洗脱液中circRNA含量进行检测，分析其可能的存在形式。
　　结果：选取第一部分成功验证中的20个睾丸来源的circRNA，无论是普遍表达基因的circRNA，还是睾丸特异性表达基因的circRNA，都能在精浆中检测出来。室温条件下精浆放置0h、12h、24h后，circRNA的表达量没有明显的差异，显示了睾丸来源circRNA在精浆中具有很好的稳定性。0.1um滤膜过滤与30kDa超滤离心柱超滤相结合过滤实验中,circRNA大部分存在于0.1um滤膜过滤后的滤液中，而将这一滤液再次经超滤离心柱过滤后，大部分circRNA被超滤膜截留在样品浓缩管中。表明精浆中游离的circRNA可能是与蛋白结合成复合物形式存在于人精浆中，两次过滤使得circRNA/蛋白复合物得到浓缩和富集。
　　结论：睾丸来源的circRNA，包含普遍表达基因及睾丸特异性表达基因的circRNA，能在精浆中被检测到，且具有很好的稳定性。其稳定性机制可能与circRNA以circRNA/蛋白复合物形式存在于精浆中，从而逃脱RNA酶降解有关。精浆中的circRNA有望成为新型无创生物标志物运用于男性生殖生理及疾病研究中。

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引言

参考文献：

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第一部分 人睾丸组织中环状RNA的测序与鉴定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 人睾丸来源环状RNA在精浆中的表达与特征

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

全文小结

综述:真核生物Circular RNA研究进展

致谢

附录一

附录二