过表达Mfn2抑制缺血缺氧/再灌注引起的反应性星形胶质细胞增殖

摘要

目的：脑梗死晚期形成的致密胶质瘢痕是神经元修复及轴突再生的重要危险因子。线粒体融合蛋白2（Mfn2）亦被称为增值抑制基因蛋白，具有在体内外抑制增殖通路信号转导及细胞周期进展，从而拮抗细胞增值促进细胞凋亡的作用。本实验探讨在体外无糖无血清/再灌注（OGD/R）模型中Mfn2在星形胶质细胞中的作用。
　　方法：实验分为缺血缺氧/再灌注0h组、缺血缺氧/再灌注6h组、缺血缺氧/再灌注12h组和缺血缺氧/再灌注24h组；在缺血缺氧/再灌注12h纯化的星形胶质细胞分为 Adv-Mfn2组 Adv-GFP组和对照组。Western-blot检测 GFAP、Ras-Raf1-ERK1/2、PCNA、CyclinD1及 Mfn2等蛋白的变化情况；流式细胞仪PI单标法检测星形胶质细胞周期进展情况；Edu免疫荧光双标法检测细胞活化增殖能力的变化；RT-PCR检测Mfn2基因RNA变化情况。
　　结果：星形胶质细胞经缺血缺氧/再灌注刺激后 GFAP表达持续上升；Ras-Raf1-ERK1/2通路蛋白、CyclinD1及PCNA表达增高，并于OGD/R12h达到高峰，之后呈下降趋势；星形胶质细胞经活化增殖后 G0/G1期比率进行性下降并于OGD/R12h达到最低值，S期及G2/M期细胞数持续性增加，并于OGD/R12h达到高峰；mfn2蛋白及 RNA变化趋势一致并与上述蛋白表达结果相反。较Adv-GFP组及对照组，高表达mfn2组星形胶质细胞的GFAP、Ras-Raf1-ERK1/2、PCNA及 CyclinD1蛋白表达显著下降，细胞周期及增殖活力显著受到抑制，而mfn2蛋白及RNA均增高。
　　结论：星形胶质细胞经无糖无血清/再灌注刺激后 Ras-Raf1-ERK1/2信号通路激活、细胞周期活化进展，mfn2蛋白及基因表达均受到抑制，从而促使星形胶质细胞增殖；高表达mfn2通过抑制Ras-Raf1-ERK1/2通路磷酸化及阻滞细胞周期于G0/G1期进而抑制星形胶质细胞增殖从而防止胶质瘢痕形成。Mfn2可望作为细胞增殖性疾病防治的新靶点，抑制星形胶质细胞的增殖为急性脑缺血治疗提供了一个新的治疗方法。

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前言

1 实验材料

1.1 动物

1.2 腺病毒

1.3 主要实验仪器和设备

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 星形胶质细胞的鉴定

2.3 腺病毒感染细胞及鉴定

2.4 缺血缺氧/再灌注模型及实验分组（OGD/R）

2.5 星形胶质细胞总蛋白的提取及浓度测定

2.6 实时荧光定量PCT(RT-PCR)

2.7 流式细胞仪分析细胞周期

2.8 细胞增殖Edu染色

3 数据分析

4 结果

4.1 星形胶质细胞的纯化和鉴定

4.2 Adv-Mfn2在星形胶质细胞中的表达情况

4.3 Mfn2的蛋白和基因表达情况

4.4 GFAP变化情况

4.5 PCNA及CyclinD1蛋白水平表达

4.6 星形胶质细胞经OGD/R处理后增殖活化情况

4.7 细胞周期进展情况

4.8 增殖信号通路Ras-Raf-ERK1/2反应激活情况

5 讨论

结论

参考文献

综述: 线粒体融合蛋白2的研究进展

致谢