HES-SPION磁共振对比剂的制备及应用研究

摘要

近几十年来，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)的合成制备及其在在化学化工、材料科学和生物医学等领域的应用研究都有了长足的发展。SPION独特的超顺磁性、低毒性及良好的生物相容性使其在生物医学中有了广泛的应用，如磁共振成像(MRI)、磁热疗、细胞标记和成像以及药物靶向转运等。但同时，SPION的使用也会产生相关的毒性问题，如诱发氧化应激、影响细胞信号转导、改变基因表达谱和干扰体内铁稳态平衡等。本论文利用所制备的羟基乙淀粉(HES)包覆的生物相容性SPION，研究了不同表面修饰后SPION的体内分布、代谢以及肿瘤MRI效果，并使用系统毒理学方法对SPION的毒性进行了初步探讨。主要研究结果如下：
　　(1)开发了一种使用羟乙基淀粉(HES200/0.5)包覆制备水溶性SPION的方法，此方法可以放大合成，实现SPION的单次大剂量制备。制备得到的SPION在水中溶解性好，水合粒径为33.65±0.92nm，zeta电位为-6.60±0.38mV(pH7.2)。在弱酸性和碱性溶液中此SPION稳定性良好，同时其水溶液以及PBS溶液在密封条件下保存36个月仍保持稳定。此SPION在室温时还具有良好的超顺磁性，磁化率好，没有剩磁，磁饱和强度为62.60emu/g，横向弛豫率R2为45.73mM-1s-1，在低静脉注射剂量(0.5mg Fe/kg)时即有明显的小鼠肝脏MRI T2加权成像效果。
　　(2)基于SPION的电负性，使用带正电的阳离子多肽如聚左旋赖氨酸(PLL)等与SPION组装得到SPIO-PLL纳米簇(nanoclusters,NCs)。TEM显示此纳米簇为球形，且可以通过调控PLL和SPION的用量精确调控SPIO-PLL NCs的粒径大小。进一步研究发现SPIO-PLL NCs的R2值与其粒径在30~140nm的范围内是正相关的。使用小鼠原位肝癌模型静脉注射(0.5mg Fe/kg)粒径分别约为33、80和120nm的SPIO-PLL NCs后，发现小鼠肝脏中1~2mm大小的原位肿瘤均能在MRI T2影像中被清晰区分出来。相较而言，粒径约为120nm的SPIO-PLL NCs对肝脏中T2信号的增强最大。而正常小鼠以相同剂量注射此三种样品，24h后各脏器中SPION分布即基本恢复到正常水平，显示出良好的组织清除率；而在静脉给药11天后，大部分SPION可以经尿液外排，且PLL的组装有利于增加SPION的外排效果，显示低剂量注射SPION的良好安全性。
　　(3)考虑到高剂量注射SPION引起的铁过载对于肝脏，尤其是对已经病变的肝脏会产生严重的毒副作用，本论文进一步使用系统毒理学方法考察不同剂量的SPION对肝脏的影响。分别以高(5.0mg Fe/kg)和低(0.5mg Fe/kg)两种剂量静脉注射后，发现高剂量SPION注射会引起肝硬化小鼠一些血生化指标在24h后出现应激性变化，如肝功能指标ALT、AST和AKP等明显升高，脂质代谢指标CHOL、HDL-C和LDL-C等明显下降，即发生急性毒理学反应，且在给药14天后其脂质代谢和血清铁水平仍不正常，显示出铁过载对肝硬化肝脏的长期毒副作用。虽然此剂量也导致正常小鼠肝功能指标于48h后应激性升高，但其水平随时间有效下降，到14天后完全恢复正常。低剂量注射SPION对肝脏则没有明显的毒副作用。RT2PCR分子毒理学分析结果表明，SPION导致的铁过载对肝硬化肝脏相关毒理学通路基因表达的影响与正常肝脏完全不同，主要表现为肝硬化肝脏中脂质代谢被加强、铁代谢失衡以及肝功能受损，显示出对肝硬化肝脏的潜在长期毒副作用。这一结果表明，SPION作为临床MRI对比剂使用时，必须考虑给药对象的组织功能和MRI成像效果，优化给药剂量，尽量减少SPION引起的铁过载对病人组织功能的负担以及损伤。
　　(4)基于高剂量SPION的潜在毒性，本论文最后初步探讨了SPIO-PDL-pHLIP NCs的特异性肿瘤靶向效果，以期为减少SPION对正常组织的影响提供一种解决方案。pHLIP是一种靶向肿瘤组织酸性微环境的细胞膜穿透肽，PDL（poly-D-lysine，聚右旋赖氨酸）在生物体内的不可降解性可以延长此纳米簇在体内转运时保持整体性的时间。结果显示，60nm左右的SPIO-PDL-pHLIP NCs有最高的肿瘤靶向效率和瘤内富集总量，而大粒径（约80、100和120nm）的SPIO-PDL-pHLIP NCs的靶向效果明显下降。此外，60nm的SPIO-PDL-pHLIP NCs在Bel7402、B16F1和H22等3种皮下瘤均有较好的靶向效果，表明SPIO-PDL-pHLIP NCs体系可能适用于多种肿瘤及其它具有微酸性环境疾病的诊断和载药治疗。
　　综上所述，本论文介绍了一种大剂量制备水溶性SPION的新方法，制备得到的SPION有良好的实际临床肝癌诊断应用前景。所制备的SPION在低剂量时表现出良好的MRI T2加权成像效果，其组织清除速率快，且可随尿液外排。但在非诊断用的高剂量静脉给药时，SPION引起的铁过载会对肝硬化肝脏造成潜在的长期毒性，引起肝脏脂质和铁代谢失常，甚至造成肝功能损失，但是对正常肝脏无不良效应。本论文最后介绍了一种以肿瘤组织酸性微环境为靶点的主动靶向SPION，并在不同肿瘤中实现了一定的肿瘤靶向效果，显示此纳米体系可能适用于多种肿瘤以及其他具有酸性微环境的疾病的诊断和载药治疗，从而为有效降低SPION的注射剂量提供了一种解决方案。

目录

声明

1. 绪论

1.1 前言

1.2 SPION理化性质考量

1.3 SPION的制备

1.4 药代动力学及靶向

1.5 毒性和生物相容性

1.6 SPION的应用

1.7 本论文的研究目的及主要研究内容

2. HES-SPION的制备及表征*

2.1 引言

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

3. SPION的MRI成像及代谢研究*

3.1 引言

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

4. SPION在肝硬化肝脏中的毒性研究*

4.1 引言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

5. SPION的肿瘤靶向研究*

5.1 引言

5.2 试剂与仪器

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 小结

6. 总结与展望

6.1 全文总结

6.2 本论文创新点

6.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间所发表的论文

附录2 RT2 PCR分析中相关基因及其对应通路

附录3 384孔分子毒理学阵列中370个相关基因及其说明

附录4 主要略缩词表（按字母顺序排列）