N6-甲基嘌呤(m6A)甲基转移酶METTL14对胰腺癌增殖和侵袭转移的影响及其机制研究

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 N6-甲基嘌呤(m6A)在胰腺癌细胞系及组织中表达水平的检测
　　目的：检测m6A在胰腺癌癌组织及癌旁组织中的含量，比较胰腺癌癌组织和癌旁组织中mA6表达丰度的差异。
　　方法：采用比色法定量检测了21例胰腺癌癌组织及相应癌旁组织，6种胰腺癌细胞系和8例正常胰腺组织中m6A的在总RNA中的表达水平，分析m6A在胰腺癌组织和癌旁组织的表达差异。采用液相色谱法定量检测了21胰腺癌癌组织及相应癌旁组织，7种胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮细胞中m6A的在mRNA中的表达水平，分析m6A在胰腺癌组织和癌旁组织的表达差异。
　　结果：与正常胰腺组织和人正常胰腺导管上皮细胞相比，胰腺癌癌组织和细胞系中的m6A是高表达的。
　　结论：m6A在胰腺癌中表达丰度是增加的
　　第二部分 N6-甲基嘌呤(m6A)甲基转移酶METTL14在胰腺癌组织中的表达与预后
　　目的：检测METTL14在120例胰腺癌病人在胰腺癌中的表达，并结合病人的临床资料，研究 METTL14在胰腺癌组织及相应癌旁组织中的表达差异，探讨METTL14表达水平与患者临床资料的相关性。
　　方法：检测METTL14在120例胰腺癌患者的在癌组织和相应癌旁组织中的表达水平，并结合病人的临床资料，分析METTL14的表达量与胰腺癌病人临床分期、病理分级、淋巴结转移和预后的关系。然后，采用real-time PCR和western blot的方法对我院胆胰外科20例胰腺癌组织标本进一步检测和确认METTL14的表达水平。
　　结果：1.与癌旁组织相比较，METTL14在胰腺癌组织中主要呈高表达，差异具有统计学意义（P<0.001）。结合临床病理资料分析显示，METTL14的表达与胰腺癌病人的淋巴结转移相关（P<0.05）。结合随访资料的生存分析显示，METTL14的高表达与胰腺癌病人的预后较差（P<0.05）。
　　2.胰腺癌组织中METTL14基因水平较相应癌旁组织增加。
　　3.胰腺癌组织中METTL14蛋白水平较相应癌旁组织增加（P<0.05）。
　　结论：METTL14在胰腺癌组织多呈高表达，高表达的METTL14胰腺癌病人的淋巴结转移相关，且提示胰腺癌病人较差的预后。
　　第三部分 METTL14对胰腺癌增殖和侵袭转移影响的体内外研究
　　目的：本部分使用3种胰腺癌细胞系作为工具，通过构建METTL14下调或过表达的稳转细胞系，研究METTL14干预对胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响。
　　方法：利用慢病毒载体has-METTL14-SH-flag和has-METTL14-flag转染转染人胰腺癌细胞Panc-1、Mia和Bxpc-3后，构建METTL14下调干预或上调干预的稳转细胞系。检测METTL14干预后m6A的变化。通过CCK8、平板克隆实验、transwell和划痕实验，分析METTL14干预后胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力的变化。使用上调和下调METTL14的稳转PANC-1细胞系，构建裸鼠皮下成瘤模型和裸鼠胰腺癌细胞脾脏包膜注射肝转移模型，评价METTL14干预后胰腺癌细胞系在裸鼠体内成瘤能力和侵袭转移能力的差异。
　　结果：1.甲基化酶METTL14可以调控胰腺癌细胞中m6A水平的变化。
　　2.在3种胰腺癌细胞系中下调METTL14，可以显著降低胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移的能力。
　　3.在胰腺癌细胞系中上调METTL14，可以显著增加胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移的能力。
　　4.裸鼠皮下成瘤模型中，下调 METTL14表达可以减少皮下成瘤的体积，上调METTL14表达可以增加皮下成瘤的体积相对于阴性对照组，差异有统计学意义。
　　5.上调METTL14的表达，可以促进裸鼠脾包膜注射肝转移模型中肝脏微转移灶的形成，下调METTL14的表达，可以抑制裸鼠脾包膜注射肝转移模型中肝脏微转移灶的形成。和对照组比较，差异具有统计学意义。
　　结论：METTL14可以调控胰腺癌细胞的m6A的变化，METTL14促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移。
　　第四部分 METTL14促进胰腺癌增殖和侵袭转移的分子机制研究
　　目的：研究METTL14通过作用于哪条可能的信号通路调控胰腺癌的恶性生物学行为。
　　方法：利用二代测序技术筛选METTL14敲减干预后发生变化的信号通路及差异的miR表达谱，再结合生物信息学的方法，预测调控信号通路的microRNA，筛选出METTL14调控的信号通路所依赖的microRNA。
　　结果：1. METTL14对MAPK通路的激活依赖于Rap1B。
　　2. METTL14可以调控miR-1-3p的表达，而miR-1-3p的靶基因是Rap1B。
　　3.阻断 Rap1B可以阻断胰腺癌 METTL14对 MAPK通路的激活，可以阻断METTL14的促进胰腺癌的增殖和侵袭转移效应。
　　结论：METTL14在胰腺癌细胞中通过抑制miR-1-3p激活MAPK通路而调控胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

前言

参考文献

第一部分 N6-甲基腺嘌呤(m6A)在胰腺癌组织及细胞系中表达水平的检测

1.1 前言

1.2 材料和方法

1.3 结果

1.4 讨论

参考文献

第二部分 N6-甲基嘌呤(m6A)甲基转移酶METTL14在胰腺癌组织中的表达与预后

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.3 结果

2.4 讨论

参考文献

第三部分 METTL14对胰腺癌细胞增殖和侵袭转移能力影响的体内外研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.3 结果

3.4 讨论

参考文献

第四部分 METTL14调控胰腺癌细胞增殖和侵袭转移的分子机制研究

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.3 结果

4.4 讨论

参考文献

全文总结

文献综述：RNA的N6-甲基嘌呤修饰（m6A）与肿瘤

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