2-APB激活CRAC通道的机制研究

摘要

钙库操纵性钙通道（SOCs）是非兴奋细胞中钙离子内流的主要通道，在调节基因表达，细胞增殖、分化、迁移、分泌，组织器官发育以及免疫应答等过程中都发挥极其重要的作用。钙离子释放激活钙（CRAC）通道是钙库操纵性钙通道中最典型的代表。细胞在静息状态时，基质相互作用分子蛋白1（STIM1）均匀的分布在内质网（ER），ER钙库耗竭时，Ca2+从EF-hand上脱落，SAM结构域（sterile-alpha motif）解螺旋，STIM1的构象发生变化暴露与孔道蛋白（Orai1） N末端与 C末端相互作用的接头最终导致钙库操纵的钙内流（SOCE）。
　　CRAC的激活过程受到多种因素的调控，这为 CRAC的药理研究提供了许多潜在目标。2-氨基乙氧基苯硼酸（2-APB）是目前研究CRAC通道的常见药物。已有研究表明2-APB对CRAC通道的调控具有浓度依赖性。低浓度的2-APB对CRAC通道有增强作用，高浓度时则出现先短暂增强后抑制的效果。然而，2-APB激活CRAC通道的药理机制目前尚不明确。
　　构建了STIM1 C末端（CT）连接双荧光标签蛋白（YFP-CT-CFP）作为荧光共振能量转移（FRET）探针以检测 STIM1的构象变化。发现2-APB使STIM1 C末端构象从紧凑型变成伸展型，同时被Orai1-mKate从细胞质募集到细胞膜（PM）附近形成高度共定位并激活 CRAC通道。Orai1激活小片段（OASF）是位于STIM1上的Orai1激活结构域，通过构建YFP-OASF-CFP质粒组装FRET探针证实了2-APB引起了OASF构象扩展性重排并激活CRAC通道。同时还发现Orai1 C末端STIM1蛋白结合结构域（CBD区）是2-APB诱导的STIM1 C末端和Orai1相互作用的关键结构域。相比较于CBD区，Orai1 N末端STIM1蛋白结合结构域（NBD区）在2-APB诱导的STIM1 C末端和Orai1相互作用上影响甚微。但是NBD区和CBD区对于2-APB诱导的STIM1 C末端和Orai1重组激活CRAC通道引发SOCE都起着重要作用。
　　推测2-APB使STIM1细胞质段结构改变，从紧凑型变成伸展型从而暴露CRAC通道激活结构域（CAD），CAD和Orai1 NBD区及CBD区相互偶联从而激活CRAC通道。

目录

声明

前言

材料与方法

1. 材料

2. 方法

2.1细胞培养

2.2细胞转染

2.3激光共聚焦成像及FRET测定

2.4细胞内钙离子的测定

2.5数据统计：

结果

1．2-APB诱导STIM1 C末端由细胞质移位至细胞膜

2.2-APB诱导STIM1 C末端构象变化并与Orai1相互作用

3. 2-APB诱导OASF端构象改变并与Orai1相互作用

4. Orai1 CBD区是2-APB诱导的STIM1 C末端与Orai1偶联的关键结构域

5. Orai1 C末端273和276是2-APB诱导的STIM1 C末端与Orai1偶联关键位点

6. 2-APB诱导的CRAC通道激活需要Orai1 CBD区和NBD区的参与。

讨论

参考文献

附录 主要符号和缩略词

综述:CRAC通道调节的结构功能机制

致谢