白腐真菌漆酶基因异源表达与污染物降解研究

摘要

漆酶因其底物广泛性，能够有效降解木质素及多种有机污染物。白腐真菌具有丰富的漆酶基因资源，故本研究以能够高效降解木质素功能的白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC162为出发菌株，在明确其胞外粗酶液对不同结构染料的降解的基础上，以漆酶基因获取、表达及污染物降解为主要研究内容。进行了漆酶基因的克隆、异源表达、分离纯化、理化性质及其对硝基苯酚类（NPs）、氯酚类（CPs）和磺胺类（SAs）有机污染物的降解及其途径研究及其降解研究。主要研究结论如下：
　　白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC162胞外粗酶液能够有效降解单偶氮类，三氯甲烷类和蒽醌类的部分染料。其中，MO(100mg/L)，CV(100mg/L)，MG(100mg/L)，BB(100mg/L)，RB4(800mg/L)和RBBR(800mg/L)在28℃，24h后的降解率依次为81.3％、87.6%、85.1%、98.0%、64.6%和89.1%。在降解体系中添加了一定浓度的漆酶特异性抑制剂（曲酸）之后，降解效果显著下降。各合成染料在相同条件下，降解率分别降至0.1%、12.9%、11.9%、18.9%、9.3%和5.1%。表明漆酶是胞外粗酶液降解染料的重要因素。
　　对来源于白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC162的三个漆酶基因（lacc6，lacc9和lacc10）在毕赤酵母中实现了异源表达。并通过发酵培养和分离纯化分别获得了三个具有漆酶活性的重组漆酶（rLACC6，rLACC9和rLACC10），其表观相对分子质量分别为64、75和64kDa。通过分离纯化之后得到的重组漆酶比酶活分别为45.50、9.36和8.56U/mg。最适反应pH分别为2.5、3.5和4.0。最适反应温度分别为60、40和40℃。对低温和偏碱性的耐受性更好。DDT和叠氮钠对三个重组漆酶的抑制效果最明显。rLACC6对金属离子和有机试剂的适应性及耐受性优于rLACC9和rLACC10。三个重组漆酶对Cu2+，K+和Na+的适应性优于其他金属离子。对丙酮，乙醇和乙腈的耐受性优于其他有机试剂。
　　进一步研究了重组漆酶（rLACC6，rLACC9和rLACC10）以丁香酸作为介体，在漆酶-介体（LMS）下对不同类型的有机污染物的降解情况。三个重组漆酶对2-硝基苯酚（2-NP）、3-硝基苯酚（3-NP）、4-硝基苯酚（4-NP）、2-氯酚（2-CP）、3-氯酚（3-CP）、4-氯酚（4-CP）、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,6-二氯酚（2,6-DCP）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲嘧啶（SMZ）和磺胺甲恶唑（SMX）在60min后的最高降解率分别为59.21%、47.91%、60.24%、41.35%、32.68%、36.72%、37.82%、35.05%、98.1%、97.5%和97.8%。降解过程均符合一级动力学方程。通过LC-MS和GC-MS检测了降解不同类型的有机污染物的过程中产生的中间产物，并推测了rLACC6对4-NP，2,4-DCP和SDZ的可能的降解途径。其中3-硝基粘康酸盐和3-氯粘康酸盐分别为4-NP和2,4-DCP降解过程中的关键中间产物。
　　综上所述，本研究通过克隆表达及分离纯化得到了三个重组漆酶（rLACC6、rLACC9和rLACC10），该重组漆酶能够对硝基苯酚类，氯酚类和磺胺类污染物实现有效的降解。通过检测降解中间产物推测了各类型污染物可能的降解途径。为漆酶资源的获取和应用打下了良好的基础。

目录

声明

1 绪论

1.1 白腐真菌

1.2 染料废水的降解研究

1.3 不同有机污染物的降解研究

1.4 本论文研究思路，技术路线和主要研究内容

2 Pleurotus ostreatus HAUCC 162胞外粗酶液对染料的降解

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

3 Pleurotus ostreatus HAUCC 162漆酶基因的异源表达

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

4 重组漆酶蛋白的分离纯化及理化性质研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 重组漆酶对有机污染物的降解研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

6 结论与展望

6.1 本论文的主要结论

6.2 展望

致谢

参考文献

附录I 硕士期间发表论文情况

附录II 相关序列信息