品系和年龄对体外诱导的小鼠BMDC表型、功能和凋亡的影响

摘要

背景：固有免疫细胞中的树突状细胞（DC），是目前已知性能最强的专职抗原提呈细胞（pAPC），其功能为识别外来抗原，并能将抗原信息加工、处理、传递给适应性免疫系统，因此树突状细胞是将固有免疫系统和适应性免疫系统紧密衔接的桥梁。DC是高度异质性的群体，依据分化成熟的阶段以及在体内分布的不同，可将DC分为功能各异的亚群。DC亚群生物学特征的差异是其影响免疫应答类型和强度的物质基础。
　　在同一抗原刺激下，遗传背景不同的个体能否产生免疫应答、以及应答的类型和强度各不相同。以实验室最为常用的两个小鼠品系为例，BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠在较多实验性诱导的过敏性疾病模型时分别呈现偏向Th1或者Th2应答。即便遗传背景完全相同的个体，处于不同年龄阶段对于同一抗原刺激的免疫应答亦存在差异，过往研究表明，相较成年鼠，新生鼠更易产生Th2应答。作为固有免疫抗原信息的接受者和适应性免疫抗原信息的提供者，DC经过其表面膜分子和分泌的细胞因子影响免疫应答类型和强度的性能已被证明。因此，不同品系和年龄的个体免疫应答类型和强度的差异极有可能与DC的数量和质量（DC的动员、表型和功能等）相关。
　　生理条件下，DC的绝对细胞数量极少，然而却分布广泛，除脑以外的所有组织和器官中基本都能鉴定出DC。考虑到直接从组织器官分离的DC在数量上难以满足科学研究的需要，对于新生鼠而言则难度更大。经过体外分化诱导培育获取的骨髓来源的DC（BMDC）解决了其他方法所获DC数目短缺的问题，可满足对DC（尤其是新生鼠DC）进行表型和功能研究的需要，还可为今后应用不同年龄体外培养修饰的BMDC进行免疫治疗提供实验依据。
　　目的：本研究拟建立不同品系、不同年龄小鼠BMDC体外培养模型，通过比较BMDC的得率和纯度，以及BMDC表面分子、分泌细胞因子谱和刺激同种异基因小鼠来源的T淋巴细胞增殖的能力在LPS刺激前后的差异，探讨DC的功能与品系和年龄的关系，为阐明上述变量影响机体免疫应答的机制奠定基础。
　　方法：
　　1.实验分组：野生型C57BL/6与BALB/c小鼠，分为三个年龄组：新生鼠（小于一周龄，1w）、三周龄鼠（3w）和成年鼠（八周龄，8w）；另外单独比较成年C57BL/6野生型和TLR4敲除鼠（TLR4 KO）；
　　2.改良的Son法建立BMDC的细胞培养体系：从小鼠的股骨和胫骨获取骨髓细胞，裂解红细胞，加入GM-CSF（10ng/ml）和IL-4（10ng/ml）培养6天诱导DC的分化，继以LPS（500ng/ml）刺激24小时，离心收集细胞和上清，分别进行相关检测；
　　3.流式细胞术检测BMDC表面标志MHC-II、CD80和CD86的表达，反映BMDC的成熟度；
　　4. ELISA检测BMDC培养上清中细胞因子TNF-?、IL-6和IL-12的含量；
　　5.混合淋巴细胞培养（MLR）检测BMDC诱导同种异基因小鼠来源的脾脏T细胞增殖的能力：获取的BMDC与来自同种异基因小鼠的脾细胞（1:5）共培养，96小时后CCK8方法检测T淋巴细胞的增殖；
　　6.流式细胞术Annexin V/PI双染法检测BMDC在LPS刺激前后的凋亡。
　　结果：
　　1. BMDC的体外培养体系被建立，并在新生鼠也获得成功。在各年龄组中，C57BL/6小鼠BMDC的得率均高于BALB/c小鼠，同一品系内各年龄组之间得率无差别。各组小鼠BMDC的纯度无差别；
　　2. C57BL/6小鼠所有年龄组在LPS刺激前后，其成熟DC（CD11c+MHC-II+细胞）占所有DC的百分比均显著高于BALB/c小鼠。C57BL/6小鼠的BMDC在基准条件下（LPS未刺激时），新生鼠CD11c+MHC-II+细胞所占百分比明显低于其他两个年龄组。LPS刺激之后 C57BL/6小鼠三个年龄组的CD11c+MHC-II+细胞所占百分比均显著升高。BALB/c小鼠在LPS未刺激时，新生鼠 CD11c+MHC-II+细胞所占百分比明显低于其他两个年龄组。LPS刺激之后C57BL/6小鼠3w和8w两组的CD11c+MHC-II+细胞所占百分比均显著升高，而新生鼠无差异。各组中CD80和CD86分子的表达水平变化趋势与MHC-II一致；
　　3. LPS刺激前，各组BMDC中几乎检测不出TNF-?、IL-6和IL-12的分泌。LPS刺激后， C57BL/6和BALB/c小鼠各年龄组BMDC分泌的TNF-?均显著提高，但在每个年龄组，BALB/c小鼠BMDC分泌的细胞因子仍然明显低于C57BL/6小鼠。在同一品系内，新生鼠BMDC分泌的TNF-?均明显低于其他两个年龄组。细胞因子IL-6的分泌情况变化趋势大体上类似TNF-?，但在BALB/c新生鼠中分泌的特点不同于TNF-?。在LPS刺激前，已有一定量的IL-6分泌，LPS刺激后也未见明显增高。IL-12的分泌情况与TNF-?类似，但在BALB/c新生鼠中分泌的特点不同于TNF-?，LPS刺激前后均未见分泌；
　　4.混合淋巴细胞培养中，C57BL/6小鼠各年龄组BMDC未经LPS刺激时，3w和8w组诱导同种异基因小鼠来源的na?ve T细胞（以下均简称为na?ve T细胞）的增殖明显高于新生鼠组。经LPS刺激后，其诱导同种异基因小鼠na?ve T细胞的增殖均呈现明显提升，其中尤以3w和8w两组最为明显，且均明显高于新生鼠组。BALB/c新生鼠BMDC刺激na?ve T细胞增殖的能力与其他两组相比最弱，且LPS刺激对之无影响。3w和8w两组经LPS刺激后，其诱导na?ve T细胞的增殖的能力均出现显著升高，且均明显高于新生鼠组，其中8w组最高；
　　5.在同一年龄组，LPS刺激前后，C57BL/6小鼠BMDC的凋亡率均低于BALB/c小鼠。经LPS刺激后，各组BMDC的细胞凋亡率均明显高于未受刺激组，尤以BALB/c小鼠为甚。BALB/c新生鼠BMDC未受LPS刺激时，其自然凋亡率已高达40%，明显高于其他未受刺激组。LPS刺激后，其细胞凋亡率达到70%，远高于其他各组；
　　6.与成年C57BL/6野生型相比，TLR4敲除鼠（TLR4 KO）BMDC的得率和纯度均与野生型无差异。其BMDC表面MHC-II、CD80和CD86分子的表达、分泌的细胞因子，刺激同种异基因小鼠T细胞的增殖以及BMDC的凋亡在LPS刺激前均与野生型无异，LPS刺激对TLR4敲除鼠以上指标均无影响，明显低于LPS刺激的野生型BMDC。
　　结论：
　　1. C57BL/6小鼠BMDC的得率高于BALB/c小鼠，年龄不影响BMDC的得率，年龄与品系均不影响BMDC的纯度；
　　2.品系和年龄可影响DC的表型、功能以及对LPS刺激的反应强度，其中C57BL/6小鼠BMDC较BALB/c成熟度更高，在同一品系内，新生鼠BMDC的成熟程度最低；BALB/c新生鼠BMDC最为不成熟，且LPS刺激不能促进其成熟度的明显提高；
　　3. LPS更易引起BALB/c小鼠BMDC凋亡，而BALB/c新生鼠BMDC的自然凋亡率和LPS诱导的凋亡远高于其他各组；
　　4.如果遗传背景相同，TLR4表达与否对BMDC的分化无影响；却影响DC在接受LPS刺激之后的表型、性能和凋亡。

目录

声明

主要中英文缩略词表

前言

实验部分

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

一、 BMDC的培养、得率和纯度

二、小鼠品系对体外诱导BMDC的表型和分泌细胞因子谱的影响

三、小鼠年龄对体外诱导BMDC的表型和功能的影响（尤其是新生鼠）

四、BMDC的凋亡

五、TLR4的影响

结论

综述:树突状细胞-免疫应答之枢纽

参考文献

致谢