GABAA受体类药物调节单核/巨噬细胞介导的心肌梗死后心室重塑作用机制的研究

摘要

本文分为以下几个部分:
　　第一部分:GABAA受体类药物影响心肌梗死后左心室重塑和实验性临床事件的研究
　　目的：探讨GABAA受体类药物对小鼠心肌梗死（Myocardial infarction,MI）后心室重塑和实验性临床事件的影响
　　方法：8~10周龄的C57BL/6小鼠经左前冠状动脉结扎后建立为MI模型，随机每天给予PBS缓冲液、GABAA受体激动剂（托吡酯）或GABAA受体阻断剂（荷包牡丹碱）腹腔注射至MI后14天。假手术组只穿线不结扎，余下的操作同模型组，术后每天腹腔给予PBS缓冲液。自MI后第1天起观察并记录小鼠的生存率，并通过对死亡小鼠的尸体解剖，确定其死亡原因；处死当天对小鼠行心脏超声和血流动力学检测其左心功能，并留取心脏标本通过2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)和Masson染色计算其梗死面积。单核/巨噬细胞去除的相关研究中，在MI模型建立前1天，模型建立后第3、6天给予氯磷酸盐脂质体，MI模型建立后依照分组（阴性对照组、普通心梗组、去除后给予PBS组、去除后给予托吡酯组、去除后给予荷包牡丹碱组）腹腔给予相应药物，并行生存率、心室破裂率，心脏超声、血流动力学，TTC、Masson染色计算梗死面积等检测。
　　结果：MI模型建立后的第1天行心脏超声检测，验证模型建立成功且不因手术操作造成组间差异。心脏超声和血流动力学检测示：在MI后14天时，和MI后给予PBS组（Control组）相比，托吡酯给药组的左心功能明显改善，而荷包牡丹碱组的心功能恶化。TTC和Masson染色示：在MI后14天时，和Control组相比，托吡酯给药组的梗死面积减小，荷包牡丹碱组梗死面积增大；Masson染色进一步提示：在MI后14天时，和Control组相比，托吡酯给药组梗死区的胶原沉积增加，而非梗死区的纤维化无明显差异，荷包牡丹碱组梗死区的胶原沉积减少，非梗死区的纤维化亦无明显差异。实验性临床事件观察统计示：MI后28天内，和Control组相比，托吡酯给药组生存率提高、心室破裂率下降，而荷包牡丹碱组的结果与之相反。脂质体去除相关研究中，MI后7天，和MI后单纯去除单核/巨噬细胞组相比，MI后去除单核/巨噬细胞组并给予托吡酯组和去除单核/巨噬细胞组并给予荷包牡丹碱组的心功能、梗死面积、梗死区胶原沉积含量、生存率、心室破裂率均无明显差异。
　　结论：GABAA受体类药物可影响MI后心脏功能、梗死面积、梗死区胶原沉积及生存率、心室破裂率。通过单核/巨噬细胞去除实验进一步表明，此作用机制可能是通过单核/巨噬细胞。
　　第二部分:GABAA受体类药物影响小鼠MI后单核/巨噬细胞极性的研究
　　目的：探讨GABAA受体类药物对小鼠MI后单核/巨噬细胞极性的影响
　　方法：首先，用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测托吡酯和荷包牡丹碱对应的GABAA受体亚基α1和β3在MI相关的免疫细胞上和心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞上是否表达。在体研究中，采用8~10周龄的C57BL/6小鼠经左前冠状动脉结扎后建立为MI模型，随机每天给予PBS、GABAA受体激动剂（托吡酯）或GABAA受体阻断剂（荷包牡丹碱）腹腔注射至处死当天。假手术组只穿线不结扎，余下的操作同模型组，术后每天腹腔给予PBS。于MI后1、3、7天，用流式细胞术检测骨髓、脾脏、外周血、心脏梗死局部Ly6Chigh型单核细胞和Ly6Clow型单核细胞的数量和比例，心脏梗死局部M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞和胚胎来源巨噬细胞（fetal derived macrophages,FDM）的数量和比例，外周血、心脏梗死局部中性粒细胞数量，脾脏Th1和Th2细胞的数量。于MI后1、3、7天，用酶联免疫法检测外周血中IL-1β的水平；于MI后1、3、7天，用荧光定量PCR法检测骨髓、脾脏、心脏梗死局部IL-1β的表达。离体实验中，小鼠巨噬细胞系（RAW246.7）分为M1型巨噬细胞相关的空白对照组，IFN-γ刺激组（Control组），IFN-γ+托吡酯给药组，IFN-γ+荷包牡丹碱给药组；M2型巨噬细胞相关的空白对照组，IL-4刺激组（Control组），IL-4+托吡酯给药组，IL-4+荷包牡丹碱给药组。干预结束后，免疫荧光法观察各组细胞中M1型或M2型巨噬细胞所占的比例；流式检测法计算各组细胞中M1型或M2型巨噬细胞所占的比例。
　　结果：GABAA受体的β3亚基在巨噬细胞和中性粒细胞上有表达，但在单核细胞、Th1、Th2上不表达，且在心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞上不表达；GABAA受体的α1亚基在单核细胞、巨噬细胞、Th1、Th2和中性粒细胞上有表达，但在心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞上不表达。在体研究中，流式细胞术示：MI后3、7天，和MI后给予PBS组（Control组）相比，托吡酯给药组的脾脏、外周血、心脏梗死局部Ly6Chigh型单核细胞数量和比例减少、Ly6Clow型单核细胞数量和比例增加，心脏梗死局部M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞或数量和比例减少、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞的数量和比例增加、FDM、Th2细胞数量增加，而荷包牡丹碱组的结果与之相反；流式细胞术示：MI后1、3、7天，和Control组相比，托吡酯组和荷包牡丹碱组的骨髓Ly6Chigh型和Ly6Clow型单核细胞数量和比例无明显变化，外周血、心脏梗死局部中性粒细胞数量无明显变化，脾脏Th1数量无明显变化。免疫组化法和流式细胞术示：MI后1、3、7天，和Control组相比，托吡酯组和荷包牡丹碱组心脏梗死局部巨噬细胞总数无明显差异。酶联免疫法示：MI后3、7天，和Control组相比，托吡酯组外周血中IL-1β的水平降低，荷包牡丹碱组的结果与之相反；荧光定量PCR法示：MI后3、7天，和Control组相比，托吡酯组骨髓、脾脏、心脏梗死局部IL-1β的表达降低，荷包牡丹碱组的结果与之相反。离体试验中，免疫荧光法示：和IFN-γ刺激组相比，IFN-γ+托吡酯给药组和IFN-γ+荷包牡丹碱给药组均对M1型巨噬细胞数量无明显改变；和IL-4刺激组相比，IL-4+托吡酯给药组和IL-4+荷包牡丹碱给药组均对M2型巨噬细胞数量无明显改变。流式细胞术示：和IFN-γ刺激组相比，IFN-γ+托吡酯给药组和IFN-γ+荷包牡丹碱给药组均对M1型巨噬细胞所占比例无明显改变；和IL-4刺激组相比，IL-4+托吡酯给药组和IL-4+荷包牡丹碱给药组均对M2型巨噬细胞所占比例无明显改变。结论：托吡酯可通过GABAA受体的β3亚基直接作用于巨噬细胞，同时，通过降低骨髓、脾脏、外周血、心脏梗死局部的IL-1β的表达和水平减少外周Ly6Chigh型单核细胞的数量。荷包牡丹碱可通过GABAA受体的α1亚基直接作用于单核细胞、巨噬细胞。在体条件下，GABAA受体类药物可影响MI后Ly6Chigh/Ly6Clow型单核细胞、M1/M2型巨噬细胞、Ly6Chigh/Ly6Clow型巨噬细胞、Th1/Th2的极化，其中，托吡酯可减少促炎性细胞Ly6Chigh型单核细胞、M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞的数量，增加抑炎性Ly6Clow型单核细胞、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞、FDM、Th2的数量。离体条件下，托吡酯和荷包牡丹碱均不能直接影响巨噬细胞的极性变化。单核/巨噬细胞去除实验表明，GABAA受体类药物调节炎症反应是主要通过作用于单核/巨噬细胞。
　　第三部分:GABAA受体类药物调节巨噬细胞活性影响心肌梗死后损伤/修复平衡机制的研究
　　目的：探讨GABAA受体类药物作用于巨噬细胞对小鼠MI后损伤/修复平衡的影响
　　方法：于MI后1、3、7、14天，用实时荧光定量PCR法、免疫印迹法或明胶酶谱法检测心脏梗死局部M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞相关的促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-9和M2型或Ly6Clow型巨噬细胞相关的抑炎性细胞因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表达；于MI后7、14天，用免疫荧光检测心肌组织中血管新生和肌成纤维细胞分化水平；于MI后7、14天，用免疫组化和苦味酸天狼星红染色法检测心肌组织中I型胶原的含量。
　　结果：实时荧光定量PCR法、免疫印迹法或明胶酶谱法示：MI后3、7、14天，和Control组相比，托吡酯组心脏梗死局部的M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-9的表达或活性降低、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞相关细胞因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表达升高，荷包牡丹碱组与之相反；免疫荧光法示：MI后7、14天，和Control组相比，托吡酯组心肌组织中血管新生和肌成纤维细胞分化水平均升高，荷包牡丹碱组与之相反；免疫组化和苦味酸天狼星红染色法示：MI后7、14天，和Control组相比，托吡酯组心肌组织中I型胶原的含量增多，荷包牡丹碱组与之相反。
　　结论：托吡酯通过减少M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-9的表达或活性，升高M2型或Ly6Clow型巨噬细胞相关细胞因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表达，从而减轻炎症反应、细胞外基质降解，增多血管新生、肌成纤维细胞分化、梗死区I型胶原沉积，最终减轻MI后炎症反应对心脏组织的损伤，增强心肌瘢痕修复。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分GABAA受体类药物影响心肌梗死后左心室重塑和实验性临床事件的研究

引言

材料与方法

结果

附图与附表

讨论

参考文献

第二部分GABAA受体类药物影响小鼠MI后单核/巨噬细胞极性的研究

引言

材料与方法

结果

附图

讨论

参考文献

第三部分GABAA受体类药物调节巨噬细胞活性影响心肌梗死后损伤/修复平衡的研究

引言

材料与方法

结果

附图

讨论

参考文献

综述:炎症反应在心肌梗死后心室重塑中作用机制的研究进展

附录一英文缩略词表及中文对照

附录二攻读博士学位期间参与课题

致谢