TO P K抑制剂抑制炎症对肿瘤转移灶克隆形成的促进作用

摘要

目的：肿瘤转移的最后阶段，即转移灶克隆形成（metastatic colonization），是最适合靶向治疗的阶段。由肿瘤或其他因素诱发的全身性炎症反应可以激活肿瘤转移休眠病灶促进其转移灶克隆形成。本文拟研究TOPK抑制剂除了抑制肿瘤细胞的作用外，是否通过干预肿瘤微环境、特别是干预肿瘤微环境中中性粒细胞的促瘤作用，从而产生更强地抑制肿瘤转移灶克隆形成的效应。
　　方法：（1）建立H22细胞荷瘤小鼠模型、B16F1肿瘤肺转移模型，观察不同剂量的TOPK抑制剂治疗效果及其毒副作用；观察shRNA转染和TOPK抑制剂对肿瘤细胞增殖的影响。气囊-LPS（Air-LPS）炎症模型小鼠：接种经CFSE染色的B16F1细胞，观测肺组织冰冻切片荧光亮斑的数目；接种B16F1细胞，观察不同时间段注射TOPK抑制剂对转移病灶形成的治疗作用。（2）ELISA检测正常、荷瘤、Air-LPS炎症小鼠血清炎症相关因子的表达。正常、Air-LPS炎症（建模后第14天）、荷瘤小鼠，以及在建立两种模型的过程中注射TOPK抑制剂的小鼠的骨髓或腹腔中性粒细胞，与H22细胞混合接种，观察不同来源的中性粒细胞对肿瘤生长的影响。Air-LPS炎症小鼠接种B16-F1细胞，同时腹腔注射anti-Ly6G单克隆抗体，观察清除体内中性粒细胞对肺转移结节形成的影响。（3）Air-LPS炎症、以及在建模过程中注射TOPK抑制剂的小鼠，Real-time PCR检测骨髓中性粒细胞促瘤相关基因Mmp-9、Bv8、Arg，iNos的表达；ELISA检测血清G-CSF、IL-6蛋白表达，Real-time PCR检测脾细胞G-csf、Il-6的mRNA表达，观察TOPK抑制剂是否抑制G-CSF和IL-6的表达；分离肌肉转染pG-CSF/pIL-6（pG/pI6）质粒小鼠的骨髓和腹腔中性粒细胞，与H22细胞混合接种，观察TOPK抑制剂是否拮抗G-CSF/IL-6对中性粒细胞的诱导作用。正常、pG/pI6的小鼠骨髓、腹腔中性粒细胞，以G-CSF和IL-6或肿瘤组织可溶性分子（T-sMs）刺激，探讨TOPK抑制剂对其基因表达的影响。（4）取正常、Air-LPS炎症、pG/pI6小鼠、以及在建模过程中注射TOPK抑制剂的小鼠的骨髓和腹腔中性粒细胞，用real-time PCR法检测抑瘤相关基因的表达；体外用T-Ms刺激，观察TOPK抑制剂在抑瘤相关基因表达中的作用；用Western blot检测p-p38MAPK和p38MAPK、p-PI3K和PI3K的蛋白水平，同时检测MPO、NE释放量，研究了TOPK抑制剂在中性粒细胞PI3K和p38MAPK信号通路激活中，以及在脱颗粒能力的恢复中起到的作用。（5）取正常小鼠骨髓中性粒细胞，用G-CSF/IL-6和TOPK抑制剂或STAT3抑制剂体外刺激培养；取正常、Air-LPS炎症小鼠的腹腔中性粒细胞，用T-sMs和TOPK抑制剂或STAT3抑制剂体外刺激培养；检测中性粒细胞促瘤和抑瘤相关基因的表达。（6）取正常、Air-LPS炎症小鼠的腹腔或骨髓中性粒细胞，用TOPK抑制剂或S TAT3抑制剂体外预处理1h，然后用G-CSF/IL-6或T-sMs刺激6h；取正常、Air-LPS炎症、pG/pI6小鼠的以及在模型制备过程中注射TOPK抑制剂或S TAT3抑制剂的小鼠的骨髓中性粒细胞；用Western blot检测p-STAT3和STAT3、p-TOPK和TOPK的蛋白水平；用Real-time PCR检测Stat3和Topk的。（7）用经TGF-β1/H2O2/HOCl（T/H/H）刺激的非转移性B16F0细胞（T/H/H-B16F0）接种Air-LPS炎症、EET小鼠建立肺微小休眠病灶模型，观察炎症、TOPK抑制剂对微小休眠病灶再生长的影响；观察体内清除中性粒细胞，潜伏病灶是否重新生长。
　　结果：（1）TOPK抑制剂对肿瘤生长有明显地抑制作用，高剂量（100mg/kg体重）具有明显的毒副作用，该组小鼠体重呈下降趋势。采用shRNA或TOPK抑制剂不能完全抑制肿瘤细胞的增殖。低剂量（1mg/kg体重）TOPK抑制剂可完全抑制肿瘤转移病灶的形成。肺组织冰冻切片结果表明，Air-LPS炎症不影响肿瘤细胞外渗；在制备炎症小鼠及对其接种B16F1细胞全程采用TOP K抑制剂治疗能有效抑制肿瘤转移病灶的形成。（2）荷瘤、Air-LPS炎症小鼠血清中G-CSF、IL-6和IL-1β浓度与正常组相比明显升高。正常小鼠骨髓和腹腔中性粒细胞抑制肿瘤生长，荷瘤、Air-LPS炎症小鼠的显著促进肿瘤的生长；经TOPK抑制剂治疗的模型小鼠的中性粒细胞能明显抑制肿瘤生长。Air-LPS炎症小鼠体内清除中性粒细胞，其肺部表面不能形成肿瘤转移结节。（3）炎症上调小鼠骨髓中性粒细胞Mmp-9、Bv8、Arg、iNos基因表达，而施加TOPK抑制剂干预可抑制这些基因的表达；TOPK抑制剂不影响Air-LPS炎症小鼠血清G-CSF、IL-6和脾细胞G-csf、Il-6mRNA的表达水平的增高。TOPK抑制剂可抑制G-CSF/IL-6对中性粒细胞功能转变为促进肿瘤生长的诱导作用，使其抑制肿瘤的生长。G-CSF/IL-6、T-sMs能刺激正常小鼠中性粒细胞Mmp9，Bv8，Arg，iNos的mRNA表达，而TOPK抑制剂能够降低G-CSF/IL-6、T-sMs的效应。pG/pI6小鼠腹腔中性粒细胞高表达这些基因，T-sMs可进一步上调这些基因的表达，而TOPK抑制剂仍可有效抑制其表达。（4）炎症、pG/pI6下调小鼠中性粒细胞Trail和Rab27a基因表达，而TOPK抑制剂可上调其表达；TOPK抑制剂治疗可使Trail和Rab27a基因表达恢复至正常小鼠水平；T-sMs刺激使pG/pI6小鼠腹腔中性粒细胞中Trail和Rab27a基因表达进一步下调，TOPK抑制剂使这些基因的表达呈升高趋势。经TOPK抑制剂治疗后，Air-LPS炎症、pG/pI6小鼠的腹腔中性粒细胞p38MAPK和PI3K的激活均可恢复至正常小鼠水平；同时MPO、NE的释放增加。（5）TOPK抑制剂和STAT3抑制剂均可单独拮抗G-CSF/IL-6对正常小鼠骨髓中性粒细胞Mmp9、Bv8、Arg、iNos基因表达的促进作用，而上调了Trail、Rab27表达；也可单独降低正常、Air-LPS炎症小鼠腹腔中性粒细胞对T-sMs的反应性，使抑瘤相关基因表达水平下调，而Trail、Rab27a表达水平上调。（6）G-CSF/IL-6或T-sMs刺激均能提高STAT3、TOPK的激活水平，同时STAT3与TOPK互不影响对方的激活。炎症、G-CSF/IL-6或pG/pI6可上调中性粒细胞的STAT3和TOPK的表达水平，而TOPK抑制剂、S TAT3抑制剂可明显抑制对方的表达；同时p-STAT3和p-TOPK的水平也下降。（7）Air-LPS炎症、EET小鼠接种T/H/H-B16F0可形成大量可见的转移结节；在建模及接种过程中注射TOPK抑制剂，则仅在肺表面形成转移潜伏病灶；体内清除中性粒细胞亦可抑制潜伏病灶重新生长。
　　结论：TOPK抑制剂不仅能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖能力，而且还可通过影响炎症微环境而抑制肿瘤转移病灶的形成。经肿瘤或其他炎症微环境诱导后转变为促瘤功能的中性粒细胞在此过程的作用不可或缺。TOPK抑制剂作用于肿瘤或其他炎症微环境中的中性粒细胞，拮抗肿瘤或G-CSF/IL6的诱导作用，通过抑制其Mmp9、Bv8、Arg、iNos等促瘤功能相关基因的表达，促进Trail、Rab27a等抑瘤功能相关基因的表达，使PI3K，p38MAP K信号通路的激活上升而增强脱颗粒作用，同时抑制STAT3的产生，从而抑制中性粒细胞向促瘤功能的转变，维持其肿瘤抑制的功能。因此靶向中性粒细胞的TOPK，可以有效地防治肿瘤转移灶克隆形成。

目录

声明

主要英文缩略词与汉语名称对照表

前言

仪器与器材

材料、试剂与方法

1. 细胞培养、分离及接种；细胞实验和动物实验

2. RNA提取、逆转录、PCR

3. Western Blot

4. 肺组织切片和染色

5. 流式细胞术

6. ELISA测定血清G-CSF和IL-6

7. 统计学处理

结果

一、TOPK抑制剂抑制炎症促进的转移灶克隆形成

二、TOPK抑制剂抑制炎症诱导中性粒细胞功能转变

三、TOPK抑制剂抑制G-CSF/IL-6诱导中性粒细胞功能相关基因的表达

四、TOPK抑制剂抑制G-CSF/IL-6对中性粒细胞Trail表达和脱颗粒的负调节作用

五、TOPK 和STAT3协调调节中性粒细胞基因表达

六、TOPK和STAT3调控彼此的表达水平

七、TOPK抑制剂抑制休眠微小转移病灶的再生

讨论

参考文献

综述：肿瘤相关中性粒细胞：癌症治疗的新靶标

致谢

附录：攻读博士学位期间发表的学术论文