高载磁性碳纳米管固定化微生物脂肪酶及其在生物柴油制备中的应用

摘要

磁性碳纳米管具有纳米级尺寸、高比表面积、大量极性官能团、丰富的孔结构、有效热传导性以及生物相容性等优点，以其为载体用于酶的固定化，使得固定化酶在反应体系中分散均匀、传质阻力低，且通过磁场作用即可方便快捷地分离、回收和利用，进而提高酶的操作性，有效降低生产成本。但磁性碳纳米管存在不能够提供足够多的反应活性位点用于酶固定化的缺点。树枝状分子不仅分子质量可控、分子内存在空腔结构，而且分子本身是纳米尺寸、分子端富含官能团，其与磁性碳纳米管结合可大大增加复合材料的活性基团，从而提高酶的加载量。此外，利用生物信息学分析酶的结构，选择合适的氨基酸残基作为共价结合的位点，以实现酶与载体的定向固定化，有效避免传统共价法由于载体与酶分子活性基团随机结合导致部分酶失活，以期获得催化性能优良的固定化酶。
　　本文以自制的两种树枝状分子（PAMAM）修饰的磁性碳纳米管复合材料（表面锚覆和管内填充）为载体，定向固定化底物特异性不同的三种代表性脂肪酶：洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶（ Burkholderia cepacia lipase, BCL）、米赫根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase, RML）和皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugose lipase, CRL），并将固定化酶用于生物柴油的制备，取得了良好的催化效果。主要的研究内容及结果摘要如下：
　　1.通过化学共沉淀法制备了Fe3O4锚覆的磁性碳纳米管复合材料（m-MWCNTs），并在其表面包覆（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES），得到氨基功能化的m-MWCNTs（ m-MWCNTs-NH2），通过发散法在 m-MWCNTs表面分级接枝 PAMAM分子（m-MWCNTs-G3），并采用SEM、TEM、XRD、SQUID、FT-IR和元素分析仪对其进行表征。TEM图谱显示MWCNTs表面结合上大量纳米颗粒；XRD图谱证实所得磁性复合材料为Fe3O4/MWCNTs，且Fe3O4晶相呈反尖晶石型，同时不影响MWCNTs的形貌；SQUID检测证明磁性复合材料具有良好的磁响应性；FT-IR检测证实PAMAM分子已经成功接枝在m-MWCNTs表面。
　　2.运用生物信息学手段分析BCL、RML和CRL三种脂肪酶分子表面活性基团对应的氨基酸残基分布。结果显示，BCL和RML的ε-氨基在酶分子上呈区域化分布，距离酶的活性中心均较远；而CRL的催化活性中心附近有个别ε-氨基存在，但相较于其他活性基团，大部分ε-氨基远离活性中心。为此，选择ε-氨基作为共价结合位点，定向固定化BCL、RML和CRL。同时，结合载体性质，选择酶分子上的羧基作为对照，分别实现了对酶的固定化。结果表明：通过酶分子上羧基固定化，固定化酶BCL的酶活回收率为120.4%、RML为1,607%，CRL为38.4%；而通过ε-氨基固定化的BCL、RML和CRL的酶活回收率分别为192.3%、2,780%和49.3%，后者分别为前者的1.6倍、1.73倍和1.29倍。确定以ε-氨基为较佳结合位点后，在水相中研究了定向共价固定化BCL、RML和CRL，通过单因素和响应面对固定化条件进行优化。结果显示，在最优条件下，三种酶的固定化率均高达85%以上，酶活回收率分别为194.1%（BCL）、2,808%（RML）和50.4%（CRL）。进一步在印迹分子诱导下，固定化酶活力均得到大幅度提高，酶活回收率分别达1,244%（BCL）、3,437%（RML）和64.8%（CRL）。酶学性质检测显示，相对于游离酶，固定化酶的pH稳定性和温度稳定性均有一定程度的提高。
　　3.通过虹吸作用制备了Fe3O4填充的MWCNTs磁性纳米复合材料（mMWCNTs），然后在其表面接枝 PAMAM分子（mMWCNTs-G3）。用一系列仪器对其进行表征，通过XPS和XRD图谱证明MWCNTs/Fe3O4纳米颗粒复合材料的合成，通过TEM电镜观察到Fe3O4纳米颗粒填充到MWCNTs管内，元素分析和FT-IR的检测结果表明PAMAM分子成功的接枝到磁性碳纳米管上，并且末端带有大量的-NH2活性基团。
　　4.以ε-氨基为结合位点，在水相中将BCL共价固定化于mMWCNTs-G3载体上，经过印迹分子诱导后，对固定化条件进行单因素优化。戊二醛添加量为8.5 wt%，pH值8.0，加酶量300 mg/0.1g，交联时间2.5 h，固定化温度30℃时，BCL的固定化效果最好，酶活回收率高达1,716%。酶学性质检测显示，相对于游离酶，固定化酶的pH稳定性和温度稳定性均有提高。
　　5.以 m-MWCNTs-G3为载体的固定化酶（ BCL&m-MWCNTs-G3、RML&m-MWCNTs-G3和CRL&m-MWCNTs-G3）作为催化剂，大豆油和生活垃圾油分别作为底物催化制备生物柴油。结果如下：对于BCL&m-MWCNTs-G3，在25 wt%叔丁醇反应体系中，5 wt%加水量、4:1醇油摩尔比、35℃反应温度下，反应24 h，转化率达到96.4%，重复使用10个批次，生物柴油得率仍维持在89%；对于固定化酶RML&m-MWCNTs-G3，在15 wt%的正辛烷反应体系中，10 wt%加水量，5:1醇油摩尔比，50℃反应温度下，反应36 h，转化率达96.2%，重复使用10个批次，生物柴油得率则维持在81%；对于固定化酶CRL&m-MWCNTs-G3，在20 wt%异辛烷反应体系中，7.5 wt%加水量、4:1醇油摩尔比、40℃反应温度下，反应40 h，转化率达到85.1%，重复使用10个批次，生物柴油得率维持在58%；而在生活垃圾油的催化中，RML&m-MWCNTs-G3表现出最好的催化效果（92.1%）。
　　6.以 mMWCNTs-G3为载体的固定化酶（BCL-mMWCNTs-G3）作为催化剂，大豆油为底物，在4 wt%加水量、5:1醇油摩尔比、35℃反应温度、3.5 wt%加酶量的条件下，反应16 h生物柴油得率达到最高（93.1%），重复使用20个批次，得率仍接近90%，酶活几乎没有损失。

目录

声明

主要缩写词

1 绪 论

1.1 脂肪酶简介

1.2 脂肪酶的分类

1.3 脂肪酶的应用

1.4 提高脂肪酶催化性能的方法

1.5 常见的固定化方法和载体

1.6 磁性载体材料的研究进展

1.7 本研究的目的意义

2 PAMAM分子修饰管外锚磁碳纳米管的制备及表征

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论与小结

3 PAMAM分子修饰管外锚磁碳纳米管固定化脂肪酶的研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论与小结

4 PAMAM分子修饰的管内充磁碳纳米管制备及表征

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论与小结

5 PAMAM分子修饰管内充磁碳纳米管固定化脂肪酶的研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论与小结

6 固定化酶在生物柴油制备中的应用研究

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论与小结

7 全文总结

致谢

参考文献

附录1 攻读博士期间发表文章

附录2 设备与仪器