NLRP3炎症小体活化参与紫杉醇诱导的神经病理痛及电针镇痛机制研究

摘要

第一部分外周神经NLRP3炎症小体活化参与紫杉醇诱导的神经病理痛机制研究 目的：建立紫杉醇诱导的大鼠神经病理痛模型;研究紫杉醇是否通过引起外周巨噬细胞浸润外周神经组织而发生NLRP3炎症小体的聚集和活化;释放促炎细胞因子;引起外周和中枢痛敏反应;并深入研究紫杉醇通过诱导ROS引起NLRP3炎症小体聚集和活化的神经免疫机制;为临床治疗紫杉醇引发的化疗后外周神经痛提供新的思路和干预靶点。 方法： （1）在SD(Sprague Dawley)大鼠多次腹腔注射紫杉醇构建神经病理痛模型;采用von Frey丝检测各组大鼠机械痛觉超敏阈值变化。 （2）在紫杉醇造模后1周、2周、3周后; 采用qPCR检测大鼠胫神经、坐骨神经和L4-L6脊神经节（dorsal root ganglion; DRG）以及腰段脊髓NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表达水平;同时采用Western blot检测上述神经组织中NLRP3、Caspase-1 p20和成熟的IL-1βp17的蛋白表达。 （3）采用免疫荧光双标组织化学方法检测坐骨神经、DRG中浸润的巨噬细胞（CD68标记）内NLRP3表达情况。 （4）通过扫描电镜观察DRG、坐骨神经的超微结构及线粒体形态。 （5）离体培养巨噬细胞NR8383细胞系;采用流式细胞术检测受损线粒体数量和产生ROS的线粒体数量。 （6）对紫杉醇诱导的神经病理痛模型大鼠给予非特异性ROS清除剂phenyl-N-tert-butylnitrone（PBN）干预治疗。 （7）对紫杉醇诱导的神经病理痛模型大鼠给予电针治疗。 结果： （1）注射紫杉醇第3天;大鼠出现神经病理痛(机械痛觉超敏);到第9天达到最低并持续到第20天未见缓解。 （2）在紫杉醇造模后1周、2周、3周后;L4-6 DRG、坐骨神经和胫神经组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA表达上调;同时NLRP3、Caspase-1和IL-1β的活化片段表达显著增加;提示外周NLRP3炎症小体的活化。但紫杉醇造模后的1周、2周、3周;腰段脊髓NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表达;及NLRP3、Caspase-1和IL-1β的活化片段蛋白表达没有显著变化。 （3）注射紫杉醇3周后;免疫荧光可见NLRP3表达于L4-6 DRG和坐骨神经中CD68标记的巨噬细胞上;而且紫杉醇可以显著上调NLRP3在巨噬细胞上的表达。 （4）电镜观察到紫杉醇注射3周后;大鼠坐骨神经中浸润的巨噬细胞和线粒体损伤（增大并肿胀）。 （5）在离体实验中;紫杉醇导致大鼠巨噬细胞系NR8383线粒体受损和ROS含量升高。 （6）给予PBN能明显改善紫杉醇诱导的机械痛觉超敏;同时下调NLRP3、Caspase-1和IL-1β的活化片段在L4-6 DRG和坐骨神经表达水平。紫杉醇诱导的DRG 和坐骨神经NLRP3表达和机械痛阈负相关。 （7）2Hz电针能够有效抑制紫杉醇诱导的机械痛觉超敏。 结论：紫杉醇诱导的机械痛觉超敏与L4-6DRG、坐骨神经和胫神经中NLRP3炎症小体的活化相平行;且NLRP3炎症小体的活化从第1周持续到第3周。紫杉醇诱导的神经病理痛的机制可能是：紫杉醇导致巨噬细胞浸润至外周神经组织;且巨噬细胞的线粒体损伤和活性氧的产生导致其自身及周围神经NLRP3炎症小体的激活;从而导致紫杉醇引起的神经病理痛。 第二部分 CB2受体参与电针抑制NLRP3炎症小体活化缓解紫杉醇化疗后神经病理痛机制 目的：本课题组之前的研究表明;电针通过激活内源性大麻素Ⅱ型受体（CB2R ）抑制炎症因子的表达;发挥镇痛作用。前期研究表明紫杉醇诱导的神经病理痛是由于外周NLRP3活化、IL-1β等表达增多引起外周神经疼痛敏化导致的;那么电针是否激活外周CB2受体抑制NLRP3炎症小体的活化而减轻神经病理痛尚不清楚。本论文旨在阐明电针治疗紫杉醇诱导神经病理痛的外周神经免疫新机制;为临床治疗化疗药物所致神经病理痛提供新思路。 方法： （1）制备腹腔注射紫杉醇诱导的神经病理痛小鼠模型;采用“up and down”方法检测小鼠的机械痛阈;采用2Hz电针刺激双侧胆经环跳穴进行治疗。 （2）取小鼠坐骨神经;采用Western blot研究电针对外周神经组织中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的活性片段蛋白表达（反映NLRP3炎症小体活化情况）和内源性大麻素受体CB2表达的影响。 （3）构建紫杉醇诱导神经病理痛模型;腹腔注射CB2受体特异性激动剂AM1241;或施加电针治疗前;腹腔注射CB2受体拮抗剂AM630;行为学实验检测小鼠机械痛阈;Western blot 检测坐骨神经NLRP3、Caspase-1 和IL-1β成熟片段的蛋白表达水平;验证内源性大麻素CB2受体是否参与了电针镇痛和抑制NLRP3炎症小体活化的过程。 （4）运用CB2受体基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠建立紫杉醇诱导神经病理痛模型;采用痛行为学和Western blot;研究内源性大麻素CB2受体是否参与电针抑制NLRP3炎症小体活化以及改善疼痛等效应。 结果： （1）本研究证明在紫杉醇诱导的神经病理痛的模型中;电针可显著改善机械痛觉超敏。 （2）电针显著下调紫杉醇诱导的小鼠坐骨神经组织炎症小体NLRP3成分、Caspase-1和IL-1β活性片段的表达水平;即抑制NLRP3炎症小体活化;同时电针能显著上调坐骨神经CB2受体的表达。 （3）在紫杉醇诱导的神经病理痛模型小鼠中;内源性大麻素Ⅱ型（CB2）受体激动剂AM1241可显著缓解紫杉醇诱导的神经病理痛模型的机械痛觉超敏;CB2受体拮抗剂AM630则可显著翻转电针的镇痛效应。 （4）在紫杉醇诱导的神经病理痛模型小鼠中;给予受体CB2受体激动剂AM1241可显著下调坐骨神经炎症小体NLRP3成分、Caspase-1和IL-1β活性片段的表达水平;即抑制NLRP3炎症小体活化。CB2受体拮抗剂AM630则可翻转电针对坐骨神经NLRP3炎症小体活化的抑制作用。 （5）在CB2基因敲除小鼠试验中;电针对紫杉醇诱导的机械痛觉超敏无显著改善作用;同窝野生型小鼠对照试验中;电针可显著减轻紫杉醇诱导的机械痛觉超敏。 （6）在CB2基因敲除小鼠试验中;电针对紫杉醇诱导的神经病理痛模型坐骨神经炎症小体NLRP3成分、Caspase-1和IL-1β活性片段的表达水平无显著影响;即不抑制紫杉醇诱导的NLRP3炎症小体活化;同窝野生型小鼠对照试验中;电针治疗则可显著抑制紫杉醇诱导的坐骨神经NLRP3炎症小体活化。 结论： （1）本研究证明在紫杉醇诱导的神经病理痛模型中;电针可显著下调小鼠坐骨神经组织NLRP3炎症小体的活化;从而发挥镇痛作用。 （2）电针对紫杉醇诱导的神经病理痛小鼠模型的镇痛效应是通过激活内源性大麻素CB2受体来实现的。 （ 3 ）电针可能通过激活外周内源性大麻素CB2受体从而抑制紫杉醇诱导的NLRP3炎症小体的活化发挥镇痛作用。

目录

第一个书签之前