IL-37和IL-37联合TnI诱导的树突状细胞在心肌梗死后心室重塑中的作用机制研究

摘要

本文从以下几个部分展开论述： 第一部分 IL-37在心肌梗死后心室重塑中的作用 背景：过度的免疫介导的炎症反应在心肌梗死后心室重塑过程中发挥着有害作用。白介素37（IL-37）是固有免疫和适应性免疫的抑制剂。然而，IL-37在心肌梗死后心室重塑中的作用仍有待阐明。 方法：我们通过结扎10周大小雄性的C57BL/6J小鼠的前降支来进行心肌梗死模型造模，并分别在心肌梗死后第1,3,7,14,28天的时间点进行统计分析。C57BL/6J小鼠被随机分入以下三个实验组：1）假手术（sham）组，前降支只穿线，不结扎；2）重组的人类IL-37处理组，1μg重组的人类IL-37以200μL的PBS稀释，心肌梗死造模前15分钟经腹腔注射入小鼠体内；3）PBS处理组，200μL的PBS，心肌梗死造模前15分钟经腹腔注射入小鼠体内。除以上处理外，以200μL的PBS稀释的1μg重组的人类IL-37或200μL的PBS，经腹腔注射入2）组或3）组，每周两次，直到指定的分析时间点。观察各组小鼠的生存率，TTC染色检测24h后心肌梗死面积，小鼠二维心脏超声检测7天和28天小鼠左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、射血分数（EF%）和短轴缩短率（FS%），masson染色检测28天梗死周围区、梗死区以及梗死遥远区的纤维化程度，Western blot检测各组IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β和MMP-2的表达，RT-PCR检测促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α以及抗炎因子IL-10、TGF-β的表达，免疫组化检测心肌梗死周围区的MPO+中性粒细胞、Mac3+的巨噬细胞以及CD3+的T淋巴细胞的浸润情况，TUNEL染色检测1天和28天心脏梗死周围区的TUNEL阳性细胞的数量，用流式细胞学检测心肌梗死7天后各组小鼠脾脏的Th1细胞、Th17细胞以及调节性T细胞分别占CD4+T细胞的比例及绝对值。 结果：我们发现与PBS处理组相比，以重组的人类IL-37处理能够显著的减轻心肌梗死后心室重塑，从如下几个方面得到证实，如心梗面积的减少，心功能的改善，死亡率的降低，炎症反应的减轻，心肌纤维化的减少，心肌凋亡的减轻。 结论：我们的结果表明，IL-37在心肌梗死后心室重塑中发挥了有益的作用，这种保护作用可能是通过减少心肌凋亡、减轻炎症反应、重建耐受性免疫反应所介导。因此，IL-37可能是一种治疗心梗后心室重塑的新型策略。 第二部分 IL-37加TnI处理体外诱导DC耐受,减轻免疫炎症反应 目的：通过体外培养小鼠骨髓来源的树突状细胞（DCs），观察和探讨IL-37加TnI处理能否体外诱导DC耐受，及其对免疫炎症反应的影响。 方法：超净台内取来源于6周大小雄性的C57BL/6J小鼠骨髓，在小鼠细胞因子GM-CSF和IL-4诱导的条件下，培养8天后，以CD11c磁珠阳性分选获得未成熟DCs（imDCs）。随机分为以下三组：1）imDCs组，imDCs不做任何处理；2）耐受型DCs（tDCs）组，CD11c阳性的imDCs以10ng/mL的LPS,30ng/mL的IL-37以及1μg/mL的TnI处理4小时；3）成熟型DCs（mDCs）组，CD11c阳性的imDCs用1μg/mL的LPS处理24h。流式细胞学检测各组细胞MHC-II、CD40、CD86的平均荧光强度（MFI）,RT-PCR检测抗炎细胞因子IL-10、TGF-β以及IDO，促炎细胞因子IFN-γ、IL-12的mRNA表达量。磁珠分选小鼠脾脏来源的CD4+的T细胞，分别与以上各组DCs进行共培养，于72h后流式细胞学检测CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及其绝对值，RT-PCR检测Foxp3、IL-10、TGF-β及IFN-γ、IL-17A的mRNA表达水平。分别以IL-37、TnI、IL-37+TnI处理imDCs，流式细胞学检测各组细胞MHC-II、CD40、CD86的MFI，以及RT-PCR检测IL-12、IL-10、IDO的mRNA水平。 结果：与mDCs相比，IL-37加TnI处理的DCs表现出了更低的MHC-II和CD40分子的MFI,而CD86的MFI这两组则没有什么差异。在mRNA水平，IL-37加TnI处理的DCs比mDCs产生了更少的IFN-γ和IL-12，IL-10和IDO的表达量则要更多，而TGF-β的表达量这两组则是相似的。DCs与CD4+T细胞共培养结果显示，与imDCs和mDCs共培养相比，与tDCs进行共培养显著的增加了CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例及其绝对值，增加了Foxp3mRNA的表达，增加了IL-10的表达。相反，tDCs比mDCs明显的减少了IFN-γ和IL-17A的mRNA的表达，而TGF-β的mRNA表达量这两组则是相似的。IL-37加TnI联合处理imDCs与IL-37或者TnI单独处理imDCs对比，MHC-II和CD40分子的MFI更低，而IL-10和IDO的mRNA表达量则要更高。 结论：以上结果表明IL-37加TnI联合处理能诱导tDCs,这种tDCs与CD4+T细胞共培养能够诱导T细胞耐受。此外，比起IL-37或者TnI单独处理imDCs，IL-37加TnI联合处理imDCs能够获得更加“耐受性”的tDCs。 第三部分 过继转输IL-37联合TnI诱导的耐受型DC减轻免疫炎症反应和心梗后心室重塑 目的：通过构建小鼠心肌梗死模型，观察和探讨过继转输IL-37联合TnI诱导的耐受型DC对心肌梗死后心室重塑和免疫炎症反应的影响。 方法：心肌梗死模型造模通过结扎10周大小雄性的C57BL/6J小鼠的前降支来进行，并分别在心梗后第3,7,28天时间点进行分析。随机分配C57BL/6J小鼠进入以下四个实验组：1）无DCs（no DCs）组，200μL的PBS于心梗造模前15分钟经尾静脉注射入小鼠体内；2）未成熟型DCs（imDCs）组，1×106imDCs以200μL的PBS稀释，心梗造模前15分钟经尾静脉注射入小鼠体内；3）成熟型DCs（mDCs）组，1×106mDCs以200μL的PBS稀释，心梗造模前15分钟经尾静脉注射入小鼠体内；4）耐受型DCs（tDCs）组，1×106tDCs以200μL的PBS稀释，心梗造模前15分钟经尾静脉注射入小鼠体内。用流式细胞学方法检测各组小鼠心梗7天后脾脏的Th1细胞、Th17细胞以及调节性T细胞分别占CD4+T细胞的比例及绝对值，RT-PCR检测心梗7天后各组小鼠心脏和脾脏IFN-γ、IL-17A、IL-12、Foxp3、IL-10以及TGF-β的mRNA表达水平，免疫组化检测心梗3天后心肌梗死周围区的MPO+中性粒细胞、Mac3+的巨噬细胞以及心梗7天后CD3+的T淋巴细胞的浸润，以masson染色检测28天梗死周围区的纤维化程度，心脏超声检测心梗后28天各组小鼠左室舒张末内径（LVEDD）和射血分数（EF%）。分别以PBS、IL-37、tDCs处理心梗后24h的小鼠，于心梗后3天行免疫组化检测心肌梗死周围区的MPO+中性粒细胞、Mac3+的巨噬细胞，于心梗7天后评估心肌梗死周围区CD3+T淋巴细胞的浸润情况。 结果：与之前的IL-37处理组相类似，tDCs处理组与no DCs组，imDCs组和mDCs组对比，显著提高了心梗后小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs的比例及其绝对值，并明显减少了CD4+IFN-γ+T细胞和CD4+IL-17+T细胞的比例及其绝对值。在小鼠心梗后7天的心脏，tDCs处理组比其他三组有更低的IFN-γ、IL-17A、IL-12mRNA表达量，而Foxp3和IL-10的mRNA表达水平则更高。而以上四组的TGF-βmRNA表达水平则没有统计学差异。此外，脾脏的这些指标结果也是相似的。与no DCs组相比，免疫组化分析显示tDCs能显著减少心肌梗死周围区MPO+中性粒细胞、Mac3+的巨噬细胞以及CD3+的T淋巴细胞的浸润，然而mDCs则显著加剧心肌梗死周围区以上三种细胞的浸润。与no DCs组相比，tDCs处理能显著减少心肌梗死周围区的纤维化面积，并减少心梗后28天小鼠心脏的LVEDD和增加EF。相反，过继转输mDCs则会加剧心肌梗死周围区的纤维化，加重心梗后28天小鼠心脏心功能。与PBS处理组相比，IL-37或tDCs处理心梗后24h的小鼠(心梗面积大小相似)仍能明显减少心肌梗死周围区MPO+中性粒细胞、Mac3+的巨噬细胞以及CD3+的T淋巴细胞的浸润，减少TNF-α的表达并增加IL-10的表达。 结论：上述结果表明，过继转输tDCs能增加心梗后小鼠脾脏Treg细胞的数量，而减少Th1细胞和Th17细胞的数量；减轻心脏梗死周围区MPO+中性粒细胞、Mac3+的巨噬细胞以及CD3+的T淋巴细胞的浸润；减轻心梗后心室重塑，并改善心功能。IL-37或tDCs处理心梗后24h的小鼠仍能明显减少心肌梗死周围区的炎症细胞浸润，减少促炎细胞因子TNF-α的表达水平并增加抗炎细胞因子IL-10的表达量，提示我们在梗死面积相似的情况下IL-37或tDCs仍能抑制炎症反应。

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