供者NK细胞多次输注减轻小鼠同种异体骨髓移植时的移植物抗宿主病

摘要

移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）是同种异体骨髓移植失败的主要原因。NK细胞在减轻GVHD、促进移植成功中起着重要作用。骨髓移植后，NK细胞的数量能在30天左右恢复，可是功能却难以恢复到正常，因为NK细胞受体库重建至正常水平至少需要3个月。 目的：在同种异体骨髓移植的小鼠模型中，本研究对受者小鼠进行供者NK细胞输注，提前改善NK细胞的功能，观察NK细胞输注的次数对骨髓移植的作用。 方法：本研究以C57BL/6J为受者小鼠，BALB/c为供者小鼠，进行骨髓移植。小鼠分为下列5组：1.空白照射组（TBI）；2.骨髓移植组（BMC）；3.骨髓移植的同时进行1次NK细胞输注组（1NK）；4.在1NK组的基础上，骨髓移植后14天加1次NK细胞输注，即2次NK细胞输注组(2NK)；5.在2NK组的基础上，骨髓移植后21天再加1次NK细胞输注，即3次NK细胞输注组(3NK)。观察各组小鼠GVHD情况，定期采取外周血主要检测供者细胞的嵌合率和白细胞计数。49天时，观察小鼠的肝、脾和骨髓中供者细胞的嵌合率、供者骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）和T、B细胞计数，并且观察肝、结肠和皮肤中GVHD病理变化情况。 结果：（1）各组小鼠GVHD情况：除TBI组之外，各组小鼠移植后出现不同程度的GVHD，3NK组的GVHD临床评分为各组最低，并且3NK组的GVHD靶器官（肝、结肠、皮肤）的病理损害最轻，BMC组损伤最严重，1NK和2NK组的损伤介于两者之间。（2）供者细胞嵌合率：外周血中，3NK组和2NK组的嵌合率高于BMC组；脾脏中，各NK细胞输注组的嵌合率高于BMC组；肝脏和骨髓中，3NK组的嵌合率高于BMC组，而1NK组和2NK组的嵌合率分别与BMC组比较，无明显统计学差异。（3）造血重建和免疫重建：42天后，在外周血中，3NK组白细胞计数高于BMC组和1NK组。42天时，在外周血中，3NK组的供者CD3+T细胞计数高于BMC组和1NK组；49天时，在骨髓中，3NK组的供者B细胞计数高于BMC组，而1NK组和2NK组的供者B细胞计数分别与BMC组比较，无明显统计学差异。（4）MDSC的情况：在骨髓和外周血中，3NK组的MDSC数量显著高于BMC组，并且以G-MDSC增多为主。1NK组和2NK组的MDSC数量分别与BMC组比较，无明显统计学差异。 结论：多次供者NK细胞输注能够明显减轻同种异体骨髓移植时小鼠GVHD，并且可以促进供者细胞植入、加速造血和免疫重建。同时，多次NK细胞输注能够明显增加MDSC的数量，可能是其减轻GVHD的机制之一。综合来看，多次供者NK细胞输注在同种异体骨髓移植中有其优势和应用价值。

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Candidate : Jiali Wei

Huazhong University of Science and Technology

ABSTRACT

Key words: NK; bone marrow transplantation; GVHD; MDSC

一、实验试剂及材料

二．实验动物

三．实验仪器

四．主要试剂配制方法

1．同种异体骨髓移植模型的建立

2．脾脏淋巴细胞的制备

3．脾脏中NK细胞的分选

4．骨髓细胞悬液的制备方法

5．小鼠GVHD情况的观察

7．外周血白细胞计数

8．肝、脾、骨髓和外周血淋巴细胞的分离

9．肝、脾和骨髓等各组织细胞计数

一、NK细胞输注减轻同种异体骨髓移植小鼠的GVHD

二、多次NK细胞输注对供者细胞植入及造血和免疫重建的影响

三、NK细胞输注对MDSC的影响

NK细胞对同种异体造血干细胞移植中GVHD的作用

GVHD的产生和治疗方法

NK细胞同种异体反应性的应用

NK细胞对GVHD的抑制作用

NK细胞与其它免疫细胞的相互作用