MiR-155调节溃疡性结肠炎肠道Th17细胞分化及复方苦参汤影响作用研究

摘要

研究目的： 溃疡性结肠炎是一类反复出现粘液脓血便，伴有腹痛，腹泻等症状的炎症性肠病。多年研究发现其发病与自身免疫系统有着密切关系，其中Th17细胞的功能异常在溃疡性结肠炎的发病过程中扮演者重要的角色。 目前许多研究也发现在溃疡性结肠炎发病过程中，Th17细胞的分化及功能异常与一类非编码RNA，即miRNAs密切相关。其中miR-155在影响Th17细胞的分化及功能方面有着重要的作用。但miR-155在溃疡性结肠炎结肠粘膜中对Th17细胞分化及功能影响的具体机制尚不完全清楚。 本实验的目的为，在TNBS诱导的大鼠结肠炎模型中，探究miR-155在结肠验证过程中对Th17细胞分化及功能的影响作用，以及复方苦参汤在此过程中的影响作用研究。本实验不仅探究了溃疡性结肠炎发病的可能机制，而且为溃疡性结肠炎探索了新的治疗方式。 研究方法： SDF级大鼠60只（6-8周）随机分为六组，分别为正常对照组、模型组、miR-155inhibition组、阴性病毒对照组、美沙拉嗪组、复方苦参汤组。实验开始第一天给予正常组以外五组大鼠TNBS灌肠造模。造模第三天给予miR-155inhibition组及阴性病毒对照组相应病毒灌肠，从第三天开始美沙拉嗪组大鼠每日给予美沙拉嗪灌胃，复方苦参汤组大鼠每日给予中药复方苦参汤灌胃。实验第十天，各组大鼠麻醉后处死，取脾脏及肠系膜淋巴结做流式细胞学检测Th17细胞含量；取各组大鼠结肠组织固定后行HE染色及免疫组化测定Jarid2含量；原位杂交测miR-155表达；冰冻切片观察病毒摄取；ELISA测结肠组织中IL-17A、IL-17F、TGF-β、IL-6、IL-21的蛋白含量；PCR测结肠组织中TGF-β、IL-6、ROR-γt、notch1及Jarid2的mRNA和miR-155的含量；western blot测Jarid2和notch1的蛋白含量。 研究结果： TNBS造模后，观察各组大鼠体重计大便情况测得DAI，与正常组比较，实验前三天，其与各组大鼠DAI明显上升，说明造模成功。第三天干预后，与模型组比较，miR-155inhibition组、复方苦参汤组及美沙拉嗪组DAI明显下降。与正常组相比较，模型组脾脏及肠系膜淋巴结Th17细胞的比例明显增高（P＜0,05），Th17细胞分化及功能相关的细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-6的蛋白含量明显升高（P＜0,05），TGF-β含量明显降低（P＜0,05），IL-6、ROR-γt的mRNA及miR-155的表达也明显升高（P＜0,05），TGF-β的mRNA含量明显降低（P＜0,05）。与模型组相比较，miR-155inhibition组、美沙拉嗪组及复方苦参汤组上述因子蛋白或mRNA的表达除TGF-β外均明显降低（P＜0,05），TGF-β蛋白和mRNA表达则明显升高（P＜0,05）。与正常相比较，模型组结肠中Jarid2的蛋白及mRNA表达明显下降（P＜0,05），而notch1的蛋白及mRNA表达则明显升高（P＜0,05）。与模型组相比较，miR-155inhibition组、美沙拉嗪组及复方苦参汤组结肠中Jarid2的蛋白及mRNA表达明显升高（P＜0,05），而notch1的蛋白及mRNA表达则明显降低（P＜0,05）。 研究结论： 1、miR-155参与TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠炎症的发生发展过程中；2、miR-155inhibition可以缓解TNBS诱导的溃疡性结肠；3、miR-155影响TNBS诱导大鼠结肠炎结肠粘膜组织中Th17细胞的分化及功能；4、miR-155可能通过Jarid2/notch1轴影响Th17细胞的分化；5、复方苦参汤可影响mRNA-155的表达并缓解TNBS诱导的溃疡性结肠炎。

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Abstract

前言

影响作用研究

1、实验材料与实验试剂

1.1 实验动物

1.2实验病毒构建

1.3实验试剂

2、实验方法

2.1 动物分组及造模

2.2 实验各组处理及标本留取

2.3 结肠炎症评价

2.4 原位杂交检测结肠组织中miR-155

2.5 RT-PCR检测结肠组织miRNA及mRNA

2.6 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测

2.7 Western bolt检测及免疫组化检测

2.8 流式细胞学检测

2.9 统计学分析方法

3、实验结果

3.1 TNBS诱导大鼠UC模型评估

3.2 miR-155 inhibition 缓解大鼠结肠炎

3.3 miR-155影响结肠炎大鼠结肠Th17细胞分化及功能

3.4 miR-155可能通过Jarid2/notch1通路影响Th17细胞分化

3.5 复方苦参汤影响miR-155含量并缓解大鼠结肠炎

4、讨论

参考文献

综述

附录1

基金资助致谢

附录2

已发表论文

致谢