中国红豆杉羟化酶基因CYP725A9和CYP725A16的克隆与功能研究

摘要

紫杉醇是来源于红豆杉属植物的一种三环二萜化合物，具有显著的抗癌功效，市场供求矛盾尖锐，药源紧缺，合成生物学技术是解决该问题的有效途径之一。紫杉醇的生物合成包括母核紫杉二烯的形成、母核的羟基化、酰基化、环氧化等20余步酶促反应。目前紫杉醇合成途径中大部分关键酶已得到解析，但母核的羟基化酶还未完全得到解析。因此，本论文拟克隆与紫杉醇合成相关的基因，并对其功能进行研究，期望找到新的羟化酶基因，为利用合成生物学技术生产紫杉醇奠定基础。 本研究基于中国红豆杉细胞转录组测序的结果，选取课题组前期研究筛选得到的紫杉醇合成相关基因CYP725A9和CYP725A16进行研究。结果如下： (1)克隆得到CYP725A9和CYP725A16基因，并对其特征进行了分析。以中国红豆杉细胞cDNA为模板，扩增得到了CYP725A9和CYP725A16基因，并利用生物信息学方法预测了编码蛋白的理化性质，预测结果表明二者均含有跨膜结构域，亚细胞定位结果表明，CYP725A9和CYP725A16编码的蛋白均锚定在细胞质膜，具有P450家族基因的典型特征。 (2)对CYP725A9和CYP725A16基因功能进行了研究。分别构建了CYP725A9和CYP725A16基因超表达红豆杉细胞系。当CYP725A9超表达后，紫杉醇及其前体DAB，Baccatin III等物质含量升高，但支路TC、TPT、TMBT、YN等多乙酰基紫杉烷含量下降，说明该基因超表达促进了紫杉醇合成代谢，同时，结合多乙酰基产物的羟化位点，推测CYP725A9可能是C1，C4或C9位羟化酶基因；CYP725A16基因超表达后，紫杉醇及其前体物质合成量减少，多乙酰基紫杉烷含量也发生了降低。通过对CYP725A9基因超表达细胞的转录组数据进行分析，发现紫杉烷合成相关基因的表达量变化和紫杉烷产物含量变化趋势一致。 (3)CYP725A9和CYP725A16基因真核表达，Western blot验证了目的基因的表达，并进行了酵母体内反应和产物检测。构建了酿酒酵母表达载体，进而电击转化WAT11菌株，获得了酵母重组菌，并提取了酵母总蛋白，采用Western blot验证了目的基因的异源表达。 综上，本研究通过克隆CYP725家族的羟化酶基因CYP725A9和CYP725A16，预测并证实了其编码蛋白的膜蛋白特征。进而通过基因超表达发现CYP725A9超表达促进了代谢向紫杉醇合成的方向进行，减弱了紫杉醇支路多乙酰基产物的合成，结合转录组分析，推测其可能为C1，C4或C9位羟化酶；CYP725A16超表达后减弱了紫杉烷合成代谢。此外，该研究通过构建酵母重组菌，验证两个羟化化酶基因的异源表达，为利用真核生物研究紫杉醇合成相关基因奠定了基础。

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摘 要

Abstract

目 录

1 绪论

1.1 课题的提出

1.1.1 紫杉醇简介

1.1.2 药用紫杉醇来源

1.2 紫杉醇生物合成

1.2.1 紫杉醇合成研究进展

1.2.2 中国红豆杉转录组数据分析结果

1.3 植物P450酶研究进展及研究方法

1.3.1 细胞色素P450概述

1.3.2 植物P450及其研究进展

1.3.3 植物P450功能研究方法

1.3.4 紫杉醇合成生物学研究进展

1.4 本研究的目的意义及主要内容

2 CYP725A9和CYP725A16的克隆及特征分析

2.1 实验材料

2.1.1 载体与菌株与材料

2.1.3 溶液及培养基

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.2 CYP725A9和CYP725A16基因的克隆

2.2.3 CYP725A9和CYP725A16基因克隆载体的构建

2.2.4 CYP725A9和CYP725A16基因的生物信息学分析

2.3 结果与分析

2.3.1中国红豆杉细胞总RNA的提取

2.3.2 CYP725A9和CYP725A16基因的克隆

2.3.3 CYP725A9和CYP725A16编码蛋白生物信息学分析

2.3.4 CYP725A9和CYP725A16亚细胞定位载体的构建

2.3.5 CYP725A9和CYP725A16基因亚细胞定位

2.4 本章小结

3 CYP725A9和CYP725A16在红豆杉细胞中的功能研究

3.1 实验材料

3.1.1 载体、菌株与实验材料

3.1.3 溶液及培养基

3.1.4 主要器材

3.2 实验方法

3.2.1 CYP725A9，CYP725A16超表达红豆杉细胞系构建

3.2.2 超表达红豆杉细胞系荧光定量PCR

3.2.3 超表达红豆杉细胞系紫杉烷提取和检测

3.3 结果与分析

3.3.1 CYP725A9和CYP725A16超表达载体的构建

3.3.2 CYP725A9在红豆杉细胞中的功能研究

3.3.3 CYP725A16在红豆杉细胞中功能研究

3.4 本章小结

4 CYP725A9和CYP725A16的真核表达

4.1 实验材料

4.1.1 载体与菌株

4.1.3 溶液及培养基

4.1.4 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 表达载体构建

4.2.2 质粒酶切验证

4.2.4 酵母阳性克隆的验证

4.2.6 酵母体内酶促反应及产物提取

4.3 结果与分析

4.3.1 表达载体的构建

4.3.2 酵母工程菌的构建及验证

4.3.3 酵母体内反应产物检测

4.4 本章小结

5 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致 谢

参考文献

附录Ⅰ 克隆的基因序列

附录Ⅱ 定量PCR引物