酿酒酵母产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的研究

摘要

乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶，一种是乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)，另一种是乙醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenase, ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛，后者使乙醛进一步转化为乙酸，最终分解为二氧化碳和水。人体中，一般都存在前一种酶，而且数量基本是相等的。但缺少后一种酶的人就比较多，ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解为水和二氧化碳，而是以乙醛的形式继续留在体内，乙醛在人体内的过渡堆积是醉酒的主要原因。目前，ALDH主要是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中分离提取，资源有限且价格昂贵。若能直接从微生物中提取乙醛脱氢酶制药或直接利用微生物制药将大大降低成本。
　　 已知酿酒酵母菌是高产ADH和ALDH的菌株，本文从中国普通微生物菌种保藏中心选择了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌As2.399。通过单因素和正交实验得到酿酒酵母产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的最优发酵培养条件。产ADH的最优培养条件是温度25℃、pH值5、250mL三角瓶发酵液的装量20mL、接种量7％；产ALDH的最优培养条件是温度30℃、pH值6、200mL三角瓶发酵液的装量20mL、接种量7％。液体发酵培养中pH值对ADH和ALDH活性的影响最大。
　　 从酵母中分离提纯ALDH是一个较为复杂的过程，ALDH为胞内产物，大部分存在于线粒体中，其他存在于胞液中，首先必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取。首先研究了破碎酵母释放乙醛脱氢酶时保护剂的作用，得出乙醛脱氢酶最佳保护剂是含有5％50mmol/LpH8.0的Tris-Cl、0.2％1mmol/L的EDTA、2％100mmol/L的NaCl的缓冲溶液。并比较了自溶法、冻融法、超声波破碎法、搅拌粗提法、珠磨法、高压破碎仪法破碎酵母细胞对释放的ALDH活性的影响，发现采用高压破碎仪进行破碎，破碎率能达到95％以上，酶的活力也大大高于其它的破碎方法，是一种较为理想的破碎方法。
　　 最后用盐析的方法对ADH进行了初步的分离纯化，比活性从粗酶液的0.464U/mg提高到1.198U/mg，纯化倍数为2.582。并研究了乙醇浓度、NAD+浓度对酶促反应的影响，分别得到：乙醇浓度的最大反应速度Vmax=0.000031mol/min，米氏常数Km=0.0045mol/L; NAD+浓度的最大反应速度Vmax=0.000611mol/min，米氏常数Km=0.0026mol/L。还研究了ADH酶的最适作用pH在7.0-10.0，活性最大时pH约为8.0，在pH7.0时较为稳定；ADH酶的最适作用温度为37℃，在30-40℃时较稳定，在45℃时酶活性急剧下降。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

第2章 文献综述

2.1 乙醇在人体内的代谢机理

2.2 国内外对乙醇脱氢酶的研究

2.2.1 ADH的基因、结构及活性

2.2.2 ADH的分离提取

2.3 国内外对乙醛脱氢酶的研究

2.3.1 ALDH的基因、结构及酶学性质

2.3.2 ALDH的分离纯化

2.3 本文研究的主要内容

第3章 实验方法

3.1 试剂与材料

3.2 仪器与设备

3.3 技术路线

3.4 实验方法

3.4.1 菌种

3.4.2 菌种的保藏

3.4.3 培养基

3.4.4 真空冷冻干燥菌种的恢复培养

3.4.5 种子的培养

3.4.6 摇床发酵培养

3.4.7 用比浊法测定菌种的生长曲线

3.5 检测方法

3.5.1 乙醇脱氢酶活性的检测

3.5.2 乙醛脱氢酶活性的检测

3.5.3 蛋白质含量的测定

第4章 酿酒酵母发酵产ADH和ALDH培养条件的优化

4.1 引言

4.2 诱导剂对ALDH的影响

4.2.1 乙醛诱导剂对产ALDH酶的影响

4.2.2 乙醇诱导剂对产ALDH酶的影响

4.3 产酶单因素实验

4.3.1 ADH和ALDH酶活随时间的变化

4.3.2 初始pH值对ADH和ALDH酶形成的影响

4.3.3 通气量对ADH和ALDH形成的影响

4.3.4 培养温度对ADH和ALDH形成的影响

4.3.5 接种量对ADH和ALDH酶形成的影响

4.4 产酶正交实验

4.5 本章小结

第5章 破碎酵母释放乙醛脱氢酶的研究

5.1 引言

5.2 前期准备实验

5.2.1 酶稳定剂的选择

5.2.2 发酵液的制备

5.3 酵母细胞的破碎对产ALDH的影响

5.3.1 自溶法的破碎结果

5.3.2 冻融法的破碎结果

5.3.3 超声波法的破碎结果

5.3.4 搅拌粗提法的破碎结果

5.3.5 珠磨法的破碎结果

5.3.6 高压破碎仪法的破碎结果

5.4 本章小结

第6章 乙醇脱氢酶的初步分离及其酶学性质的研究

6.1 引言

6.2 乙醇脱氢酶的初步分离

6.2.1 ADH粗酶液的制备

6.2.2 盐析法初级分离ADH

6.3 乙醇脱氢酶酶学性质的研究

6.3.1 乙醇脱氢酶的动力学研究

6.3.2 酶的最适作用pH

6.3.3 酶的pH值稳定性

6.3.4 酶的最适作用温度

6.3.5 酶的热稳定性

6.4 本章小结

第7章 结论与建议

7.1 结论

7.2 对后续工作的建议

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢