结合机械切削的倾斜入射光片照明三维高分辨率荧光成像

摘要

脑功能的探索;特别是大脑神经回路的研究;进入了一个迅速发展的时期;脑研究除了能增加人们对自身的认识和了解;发展脑神经疾病的治疗方法;还对人工智能等前沿技术有参考和推动作用。随着研究的深入;脑研究对大体积三维高分辨率的成像方法与系统的要求越来越高。目前;有许多成像技术能够在大体积范围内对神经纤维投射进行获取与追踪。然而这些成像技术还存在不足;使用了共聚焦或双光子这一类点扫描策略的成像技术;难以获取与横向分辨率相当的轴向分辨率;同时点扫描成像通量难以提高;多采用牺牲部分采样率的方式以缩短成像时间;导致成像分辨率的降低。组织光透明结合光片照明的成像技术;在大体积样本上很难获得轴向高分辨率。轴向分辨率较低导致精细结构的真实三维形状与位置难以获得;如何能够提高轴向采样率与分辨率;高通量地获得三维精细结构信息;是有待解决的问题。 针对大体积范围内获取三维高分辨率这一需求;本文提出了使用倾斜入射的光片照明成像结合机械切削的策略。利用较高数值孔径的照明物镜与探测物镜获得轴向和横向亚微米量级的高分辨率;使用平台扫描结合面阵探测器的亚阵列模式高通量地对照明光片最薄区域进行快速成像;保证足够的采样分辨率以及成像速度。 基于上述成像策略;本文针对性地解决了倾斜入射光片照明成像方法用于树脂样本时影响成像质量的一系列问题。根据组织光学的理论;对非透明样本受组织散射与吸收的情况进行了研究;使用后期图像补偿的方法;提高了成像结果的轴向信号均匀性。针对成像介质与样本的折射率失配的情况;根据波动光学相关理论;对倾斜入射光片照明成像的像差进行了计算分析。研究了通过改变照明与探测光路孔径抑制像差的方法;得到了综合而言最优化的孔径形状与尺寸;保证了三维亚微米量级的分辨率以及足够的信号强度。总体上;改进了倾斜入射光片照明显微成像方法使之更适合用于机械切削样本。 在上述工作的基础上;本文研制了一套机械切削光片照明成像系统。按照一般显微成像系统的实现流程;设计了照明模块与探测模块;优化了光路结构与光路调节方式;发展了倾斜数据的层内与层间重建方法;完成了成像系统整体硬件与软件的构建。对系统的三维分辨率进行了测试;实现了三维亚微米分辨率;测试分辨率达到0.59×0.45×0.59μm3。最后按照大体积样本成像数据获取步骤;对2;mm3体积的小鼠脑块进行了三维精细成像;在2小时内完成了采样率为0.23×0.16×0.12μm3的数据获取。测试与成像结果证实了本系统在大体积样本上获取三维亚微米分辨率的能力;通过对比说明了提高轴向采样率;分辨率对精细结构形貌特征及位置信息获取的重要性;展示了本系统所获得结果对精细结构进行判断的可靠性与精确性。本系统展现了其在脑神经科学及更多其他研究中发挥作用的潜能。

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