银杏MECT、MECPs基因启动子克隆及植物表达载体构建

摘要

银杏萜内酯是从银杏叶中提取的一种重要的药物活性成分,具有保护中枢神经系统、降低缺血损伤、抗休克、抗过敏等多方面的药理作用,因而成为近几年的研究热点。为了解萜内酯合成的代谢网络,深入研究其合成过程的分子机理,并为利用生物技术提高萜内酯含量提供可靠依据。本实验以银杏家佛手为研究材料,采用染色体步移的方法从银杏中克隆了萜内酯合成MEP途径中的两个关键酶基因2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(GbMECT)和2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(GbMECPs)的启动子序列,并对其调控元件进行了初步分析,在获得启动子序列后对其中的GbMECPs启动子进行了植物表达载体构建。本研究主要内容包括：
　　⑴银杏2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因(GbMECT)启动子克隆及序列分析。通过设计特异性引物及采用染色体步移方法从银杏基因组中克隆到GbMECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件,主要有典型的光响应调节元件GATA-box(GATA)、GT-1 motif(GRWAAW)及I-box(GATAA)等;抗逆境胁迫及与激素响应相关的调控元件包括:细胞分裂素响应元件ARR1(NGATT)和CPBCSPOR(TATTAG),脱落酸响应元件MYC(CANNTG)和MYB1AT(WAACCA),赤霉素响应元件WRKY-motif(TGAC)、GARE(TAACAGA)及GA-element(TAACAAR)等,生长素响应元件ASF-1motif(TGACG)和乙烯响应元件ACS(TAAAATAT),另有抗病虫害响应元件TGTCA序列,抗损伤应答元件ERF3(TGACY)和高温胁迫应答元件HSE-motif(CCAAT)等。在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件,充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。
　　⑵银杏2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶基因(GbMECPs)启动子克隆及植物表达载体构建。通过染色体步移方法从银杏基因组中克隆到长约为744 bp的GbMECPs启动子片段,生物信息学分析表明,该启动子序列含有多个基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box,及典型的光调节元件GT-1motif(GRWAAW)、Circadian box(CAANNNNATC)等。进一步分析发现,该调控序列还包含对生长素、赤霉素、乙烯利、细胞分裂素、脱落酸等各种激素应答相关的调控元件及MYB、MYC转录因子介导的多种逆境胁迫诱导元件。将克隆的GbMECPs启动子替换质粒pBI121中的35S启动子,成功构建了由 GbMECPs启动子驱动 gus报告基因的植物表达载体pBI121+GbMECPs。下一步拟用农杆菌介导法将重组质粒转入烟草,为深入研究该启动子组织特异性表达及胁迫诱导机理分析奠定基础。

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第一章 文献综述

1 银杏叶萜内酯类化合物的生物合成研究进展

1.1 银杏萜内酯的化学结构、种类和分布

1.2 萜内酯类化合物的药理作用

1.3萜内酯的生物合成过程及途径

2 植物基因启动子结构与功能研究

2.1 植物基因启动子的基本结构和特点

2.2 植物基因启动子的类型

2.3 植物基因启动子的克隆方法

2.4 启动子的生物信息学分析

2.5 植物基因启动子功能检测

3 银杏萜内酯关键酶基因启动子克隆研究的目的和意义

第二章 银杏MECT基因启动子克隆及序列分析

1 材料及试剂

1.1 实验材料

1.2 酶与分子生物学试剂

1.3 主要仪器

1.4 DNA提取试剂

2 试验方法

2.1 银杏DNA提取

2.2 琼脂糖电泳检测

2.3基因组酶切与连接

2.4引物设计及染色体步移扩增

2.5 目的片段回收、片段与载体连接、转化及测序

2.6 生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 银杏基因组DNA提取

3.2 银杏MECT基因启动子序列克隆及验证

3.3 GbMECT基因启动子区域序列的生物信息学分析

4 小结与讨论

第三章 银杏MECPs基因启动子克隆及植物表达载体构建

1 实验材料与方法

1.1 实验材料和仪器

1.2银杏基因组DNA的提取

1.3 引物设计及步移扩增

1.4 扩增结果检测及目的条带回收

1.5表达载体pBI121+GbMECPs的构建

1.6 植物表达载体向农杆菌转化

2 结果与分析

2.1 GbMECPs启动子区域序列克隆

2.2 银杏MECPs基因启动子区域序列的生物信息学分析

2.3 含GbMECPs启动子的植物表达载体

2.4 GbMECPs表达载体转化农杆菌

3 小结与讨论

4 结论与展望

参考文献

攻读硕士期间已发表的论文

致谢