增液承气汤对津亏便秘衰老模型小鼠皮肤影响的实验研究

摘要

目的：通过皮下注射D-半乳糖、限水叠加复方地芬诺酯灌胃建立津亏便秘衰老模型，观察该模型动物相关的皮肤衰老指标，以评价便秘对皮肤衰老的影响，并通过增液承气汤作用于该复合模型，探讨其对皮肤作用的可能机制，从现代医学角度诠释中医学“肺外合皮毛，肺与大肠相表里”理论。
　　 方法：将144只2月龄昆明清洁级小鼠雌雄各半随机分为空白组、津亏便秘组(简称便秘组)、衰老组、津亏便秘衰老组(简称便秘衰老组)、增液承气汤(0.6g生药/ml)组、西沙必利组(西药组，2.5mg/kg)和增液汤组(0.51g生药/ml)。其中便秘组采用限水(1.5ml/d)，叠加复方地芬诺酯(10mg/kg.d)灌胃建立津亏便秘模型，灌胃顺序依次为超纯水(20ml/kg.d)、复方地芬诺酯(10ml/kg.d)、超纯水(补充余量)，间隔3小时；衰老组每天颈背部皮下注射等量D-半乳糖1000mg/kg造模；便秘衰老组及其治疗组两法同用建立便秘衰老复合证候模型；空白组以超纯水做对照；共6周。从第4周开始对增液承气汤组、增液组及西药组进行相应灌胃处理(将第一次的超纯水改为药液)，持续3周。每周称量体重一次，实验结束后当天进行宏观体征观察并拍照，次日取材进行如下实验：皮肤的光电镜检测；小肠墨汁推进率观察；计算大肠和皮肤含水率；此外生化检测血清和皮、肺SOD、皮和血清HYP；用放射免疫方法检测皮肤组织匀浆HA含量；用免疫印迹检测皮肤AQP3和肺AQP1表达；用实时荧光定量PCR检测真皮TGFβRⅠ/ⅡmRNA表达。
　　 结果：
　　 1.与空白组比较，便秘组、衰老组与便秘衰老组的各项指标显示有显著性差异(P＜0.05)。
　　 在宏观体征观察中各组表现出不同程度的衰老表现如形体消瘦，精神倦怠，活动后活动量减少，蜷缩聚堆，眯眼，弓背，且皮毛枯槁无光泽；相比，便秘组还表现出易激惹的症状；便秘衰老组的皮毛最为枯槁，形体最为消瘦，更急躁易怒。
　　 对组织标本进行检测，结果显示小肠推进率明显下降(P＜0.01)；大肠和皮肤含水率下降(P＜0.01)；皮肤明显变薄，胶原纤维数量减少；皮肤成纤维细胞存在明显线粒体水肿，异染色质发生边集，常染色质淡染或核染色致密成团的超微结构改变；血清、皮肤及肺组织中SOD活力明显下降(P＜0.01)，血清和皮肤组织中HYP含量减少(P＜0.01)；皮肤组织匀浆中HA含量锐减；皮肤AQP3和肺AQP1表达明显减少(P＜0.01)；真皮TGFβRⅠ/ⅡmRNA表达强度明显下降(P＜0.01)。且便秘组、衰老组差别不大(P＞0.05)，相比便秘衰老组变化程度较大。
　　 2.与便秘衰老模型相比，增液承气汤和增液汤对该模型小鼠的宏观体征如爪的形态、活动度等有一定改善，进食量和体重也有所增长，表现为爪甲淡红；西沙必利组小鼠仍爪甲偏红。
　　 对组织标本进行检测，结果显示增液承气汤、增液汤治疗、西沙必利对便秘衰老复合证候模型小鼠小肠推进率，血清、皮肤组织中SOD活力和HYP含量，皮肤AQP3和肺AQP1表达，真皮TGFβRⅠ/ⅡmRNA表达，有显著改善(P＜0.05，P＜0.01).在皮肤(大肠)含水实验中西沙必利的干预效果明显不及增液承气汤和增液汤(P＜0.05)。表现为增液承气汤组小鼠大肠和皮肤含水率明显增加(P＜0.01)；小鼠皮肤明显增厚，真皮胶原纤维数量增加，皮下脂肪填充减少；成纤维细胞损伤明显减轻，其核内染色质分布较均匀，核膜下异染色质聚集，胞浆内可见大量粗面内质网及线粒体；肺组织中SOD活力明显增强(P＜0.01)；皮肤组织匀浆中HA含量明显增加(P＜0.01)；皮肤AQP3和肺AQP1表达明显增强(P＜0.01)；真皮TGFβRⅠ/ⅡmRNA表达强度明显增加(P＜0.01)。
　　 结论：
　　 1.便秘可导致皮肤衰老、加促皮肤衰老进程。
　　 2.D-半乳糖皮下注射法复合“灌水+复方地芬诺酯灌胃+灌水”的“三明治”法构建的小鼠模型是一种易于掌握、重复性高的津亏便秘衰老复合病证模型。
　　 3.增液承气汤具有明显的增水推舟、泄热通便功效，并能较好改善便秘衰老模型动物的宏观体征。
　　 4.机体自由基的清除能力下降、SOD活力下降，HYP含量降低、TGF-βRⅠ/Ⅱ信号转导通路受阻；皮肤组织HA含量减少、AQP3表达下调，可能是津亏便秘衰老模型小鼠皮肤菲薄、干燥的病理机制。肺组织AQP1表达下降与SOD活力低下可能是津亏便秘衰老模型小鼠皮肤老化的中间环节。
　　 5.增液承气汤可有效改善证候模型小鼠的皮肤老化与皮肤组织改变，其作用机理可能与加强清除自由基，减少组织损伤；唤醒TGFβ信号转导通路，促进成纤维细胞的增殖与细胞外基质成分的合成，改善微循环血供；上调皮肤AQP3的表达及增加HA含量；增强肺组织SOD活力，促进肺组织AQP1合成，提高肺抵抗氧化应激的能力，恢复肺行水布津之能，达到濡养润泽皮肤，延缓皮肤衰老的作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分 理论探讨

1皮肤衰老的中医病机探讨

1.1虚实夹杂是皮肤衰老发生、发展的基本病机

1.2脏气虚衰，魄门失职，腑气不通加促皮肤衰老

2滋养阴液，润肠通便、逐痰祛瘀是改善皮肤老化的有效途径

3增液承气汤的组方分析

3.1增液承气汤的出处与组方依据

3.2增液承气汤的现代临床应用研究

3.3增液承气汤的现代药理学研究

第二部分实验研究

实验一津亏便秘衰老模型小鼠宏观体征的观察

实验二津亏便秘衰老模型模型小鼠小肠推进率的检测

实验三津亏便秘衰老模型模型小鼠大肠含水率的检测

实验四津亏便秘衰老模型模型小鼠血清(皮肤)SOD和HYP的检测

实验五津亏便秘衰老模型模型小鼠皮肤组织形态学的检测

实验六津亏便秘衰老模型模型小鼠皮肤含水率与HA含量的检测

实验七津亏便秘衰老模型模型小鼠真皮TGFβRI／Ⅱ表达的检测

实验八津亏便秘衰老模型模型小鼠皮肤AQP3表达的检测

实验九津亏便秘衰老模型模型小鼠肺AQP1表达的检测

实验十津亏便秘衰老模型模型小鼠肺SOD的检测

讨论

1津亏便秘衰老模型的评价

2津亏便秘衰老模型小鼠皮肤老化的病理机制

2.1津液亏虚是皮肤老化的前提条件

2.2自由基是引起皮肤老化的原因或加剧皮肤老化的诱因

2.3阻抑TGF-βRⅠ／Ⅱ信号转导通路是真皮成纤维细胞数目减少、增殖能力的下降又一重要病理机制

2.4肺组织日趋老化是长期便秘患者皮肤易于老化的关键环节

3增液承气汤对津亏便秘衰老模型模型小鼠的作用机理

4本课题的创新之处

结语

参考文献

附录

发表论文及获得奖励

文献综述

致谢