“双固一通”针法对绝经后骨质疏松症模型大鼠OPG/RANKL/RANK系统的调节

摘要

目的：
　　 观察“双固一通”针法对去卵巢绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis，PMO)模型大鼠调节骨吸收平衡的相关细胞因子系统--护骨素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptoractivator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)系统的影响，进一步探讨“双固一通”针法治疗本病的作用机制，为针灸治疗PMO提供新的思路和方法，为临床预防和治疗PMO提供实验依据。
　　 方法：
　　 依随机原则将50只SD大鼠分为对照组、模型组、常规取穴针刺组(简称常规组)、“双固一通”针刺组(简称双固一通组)和中成药治疗组(简称中成药组)，每组10只。模型组、常规组、双固一通组和中成药组切除双侧卵巢后常规饲养，造成实验性PMO动物模型。90天后常规组、双固一通组采用电针治疗，中成药组早晚予仙灵骨葆胶囊灌胃治疗(早晚以0.4g/次灌胃，药液量以生理盐水溶解，调整至3ml)，对照组、模型组早晚予生理盐水3ml灌胃，用药期间常规饲养。疗程均为8周。电针治疗(采用四川恒明科技开发有限公司生产HM-6805型经穴治疗仪，疏密波8～80Hz，疏密波转换14次/分钟，电压1.5V，强度1mA左右，通电15min)，每天1次，每次15分钟，留针10分钟，连续治疗6天后休息1天，共治疗8周。常规组取穴：脾俞、胃俞、肾俞，气海俞，均为双侧；双固一通组取关元、后三里(双)、肾俞(双)、膈俞(双)、大杼(双)。用全自动生化仪测定血清钙(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和尿钙、尿磷、尿肌酐；用放射免疫法测定血骨钙素(Osteocalcin，BGP)；用酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA)测定尿脱氧吡啶啉(Deoxypyridinoline，DPD)的含量；用化学发光免疫分析法检测雌二醇(estradiol，E2)；ELISA法检测白细胞介素(interletukin，IL)-6、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、OPG、RANKL、RANK；双能X线骨密度仪检测骨密度(bone mass density，BMD)；HE染色观察大鼠骨组织形态学的变化；反转录聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测M-CSF、OPG、RANKL-mRNA表达及OPG/RANKL。大鼠因造模手术、麻醉、灌胃死亡，取材时各组大鼠数量如下：对照组8只，模型组6只，中成药组6只，常规组6只，双固一通组7只。
　　 结果：
　　 1模型组血Ca值明显降低、血P值明显升高、血ALP值明显升高、BGP明显升高，有非常显著性差异(P<0.01).与模型组比较，双固一通组和中成药组血Ca明显升高、血P明显降低、血ALP明显降低，BGP明显升高有非常显著性差异(P<0.01)；双固一通组优于常规组(P<0.01)。
　　 模型组尿Ca/Cr、P/Cr比值明显升高，有非常显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，各组Ca/Cr、P/Cr比值均降低，常规组有非常显著性差异(P<0.01)，双固一通组Ca/Cr有非常显著性差异(P<0.01)，P/Cr有显著性差异(P<0.05)；双固一通组与中成药组和常规组比，无显著性差异(P>0.05)。
　　 模型组尿DPD明显升高，有显著性差异(P<0.05)。与模型组比较，双固一通组尿DPD含量明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)；双固一通组与中成药组和常规组比，无显著性差异(P>0.05)。
　　 模型组血Ca明显降低、而血P、ALP值明显升高、血BGP明显升高(P<0.01)；尿Ca/Cr、P/Cr明显升高(P<0.01)，尿DPD明显升高(P<0.05)。说明去卵巢骨质疏松症模型大鼠呈现高骨转化率，骨吸收增加，伴随骨形成代偿性增加，骨量减少，预示骨密度降低，与临床常见的PMO女性的骨高转换率极相似，提示造模成功。而“双固一通”针灸治疗后，BGP显著升高，提示成骨细胞(OB)活性增强，骨形成增加。双固一通组、中成药组均可升高血钙，降低血磷，降低尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD；常规组可升高血钙，降低尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD，对于血P无明显的降低作用。说明中医药治疗可以调节Ca、P代谢，促进骨形成，减缓骨吸收。
　　 2模型组腰椎BMD明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组腰椎BMD均明显升高，有非常显著性差异(P<0.01)。与双固一通组比较，有显著性差异(P<0.05)。与对照组比较，模型组股骨BMD明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组股骨BMD均明显升高，有显著性差异(P<0.05)；与双固一通组比较，各组无显著性差异(P>0.05).
　　 3光镜观察结果显示：模型组骨小梁稀疏、细、中断点多、间距宽，部分区域出现较大的空白区域。常规组、中成药组、双固一通组的骨小梁增多、增粗、间隙变窄，中断点减少，三组间的区别不明显。双固一通的骨小梁排列密集，相互之间的连接明显增多，宽度增宽，体积增大，间隙变窄。
　　 4模型组血清IL-6明显升高，E2明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组血清IL-6均降低，E2明显升高，有非常显著性差异(P<0.01)。与中成药组比较，双固一通组和常规组血E2无显著性差异(P>0.05)。双固一通组优于常规组和中成药组(P<0.01)。在本实验中模型组E2水平降低，IL-6含量增高，与既往的研究结果一致。“双固一通”针灸治疗后，大鼠血E2显著升高、IL-6显著下降(P<0.05)，双固一通组优于常规组和中成药组。表明“双固一通”针法治疗能够升高雌激素，抑制IL-6分泌，抑制OC的活性，促进骨的形成。
　　 5模型组血M-CSF明显升高、OPG明显降低、RANKL明显降低、RANK值明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，双固一通组、常规组和中成药组M-CSF明显降低、OPG值明显升高、RANK明显升高，有非常显著性差异(P<0.01)；与模型组比较，中成药组血清RANKL升高，常规组血清RANKL有降低趋势，但均无显著性差异。双固一通组优于常规组和中成药组。说明针刺可以通过提高血OPG、RANKL、RANK的含量，降低M-CSF，从而抑制破骨细胞(osteoclast，OC)的骨吸收来减少骨量的丢失，且“双固一通”针法优于其它方法。
　　 6模型组骨M-CSFmRNA表达较对照组明显升高，有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组M-CSFmRNA表达均降低，有非常显著性差异(P<0.01)。与双固一通组比较，常规组M-CSFmRNA表达升高，有显著性差异(P<0.05)，中成药组有非常显著性差异(P<0.01)。中成药组、常规组、双固一通组均有效，但双固一通组效最好。
　　 模型组骨OPGmRNA表达较对照组明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，各治疗组OPGmRNA表达均升高，有非常显著性差异(P<0.01)。与中成药组和常规组比较，双固一通组有非常显著性差异(P<0.01)，与对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。中成药组、常规组、双固一通组均有效，但双固一通组效最好。
　　 模型组骨RANKLmRNA表达较对照组明显降低，有非常显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，双固一通组骨RANKLmRNA表达升高，有非常显著性差异(P<0.01)，中成药组和常规组RANKLmRNA表达与模型组比无显著性差异(P>0.05)。双固一通组与中成药组比有显著性差异(P<0.05)。双固一通组有效，中成药组和常规组均无效。
　　 模型组骨OPG/RANKL比值较对照组显著降低，有显著性差异(P<0.05)。与模型组比，双固一通组骨OPG/RANKL比值升高，有非常显著性差异(P<0.01)，中成药组与模型组比有显著性差异(P<0.05)，常规组与模型组比无显著性差异(P>0.05)。中成药组与双固一通组均有效，但双固一通组效更好。
　　 本研究结果表明：模型组骨M-CSFmRNA表达明显升高(P<0.01)，提示OC生成增加；各治疗组M-CSFmRNA表达均降低(P<0.01)，表明中医药治疗尤其是“双固一通”针法可以抑制OC数量，或降低OC活性，减缓骨吸收。模型组骨OPG、RANKLmRNA表达显著降低(P<0.01)，提示OPG蛋白表达降低，破骨吸收增加；RANKL蛋白表达降低，OPG与RANKL结合有一定程度的阻滞OC生成的作用，而综合作用仍表现为骨吸收的增加。OPG/RANKL比值能反映成骨细胞(osteoblast，OB)的形成，比值越大，OB介导的能力越强；englixibaoweiia促进骨吸收，限制骨矿化的速度。
　　 模型组骨OPG/RANKL比值表达较对照组明显降低，提示骨形成降低。双固一通组骨OPG、RANKLmRNA表达明显升高(P<0.01)、RANKLmRNA表达降低(P<0.01)，OPG/RANKL比值明显升高(P<0.01)，提示“双固一通”针法可能通过促进OPG蛋白表达，提高OB活性，通过与RANK竞争和RANKL的结合，阻止OC的生成，阻止骨吸收。
　　 结论：
　　 通过本课题的研究，我们认为：“双固一通”针法对OPG/RANKL/RANK的调节是多环节、多途径的：
　　 1“双固一通”针灸治疗后，BGP显著升高，提示成骨细胞活性增强，骨形成增加；血钙升高，血磷降低，尿Ca/Cr、尿P/Cr、DPD降低，提示“双固一通”针灸治疗可以通过增加胃肠吸收功能，促进对钙、磷等各种营养物质的吸收和利用，调节Ca、P代谢，降低尿Ⅰ型胶原分解产物DPD浓度，提高BGP浓度，从而抑制骨吸收、促进骨形成，最终使骨矿含量增加，维持甚至提高骨密度。
　　 2“双固一通”针灸治疗能通过提高去卵巢骨质疏松症模型大鼠E2的水平，减少IL-6含量，加强雌激素对IL-6的抑制作用，减少OC的前体细胞形成，抑制骨吸收，表现为BMD的升高、模型大鼠骨组织形态结构的改善。
　　 3“双固一通”针灸治疗能升高去卵巢骨质疏松症模型大鼠血清OPG、RANKL、RANK含量和降低M-CSF水平，以抑制OC的活性而减少骨吸收，减少骨量的丢失。
　　 4“双固一通”针灸治疗能升高去卵巢骨质疏松症模型大鼠血清OPG、RANKL、RANK含量和降低M-CSF，以抑制OC的活性而减少骨吸收，减少骨量的丢失；“双固一通”针灸治疗能通过降低去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨M-CSFmRNA表达来抑制OC数量，或降低OC活性，减缓骨吸收；通过升高骨OPGmRNA表达，升高RANKLmRNA的表达，提高OB活性，通过与RANK竞争和RANKL的结合，阻止OC的生成，阻止骨吸收；通过升高OPG/RANKL比值，调节OPG/RANKL/RANK，能抑制OC活性，拮抗骨吸收。