电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织血管新生及HGF、HIF-1α表达的影响

摘要

目的：脑血管病的发病率,死亡率及致残率均很高,为三大致死病因之一,每年死于脑卒中的患者约150万人,其中75％～85%为缺血性脑血管病(isthemic cerebral vascular disease,ICVD)。局灶性缺血性脑血管病是由于脑血管被血栓因子或其他病理代谢产物阻塞,从而导致脑血管供血范围的脑血流量下降,使脑局部的组织缺氧和脑细胞的死亡,形成以中心坏死区及其周围的缺血半暗带组成的局部梗死病灶。研究发现脑缺血后形成的缺血半暗带有大量的细胞凋亡。此时机体需做出反应来维持机体氧的平衡与稳态来抵抗这种不利因素,其中一种重要机制就是诱导新生血管形成,改善侧支循环,增加脑血流量来补偿血氧代谢的不足以挽救濒死的神经细胞。若在此时能够运用有效的手段来改善缺血区局部的血液循环,增加脑血流量来补偿血氧代谢的不足,则可阻止缺血半暗带细胞凋亡,保护脑神经。既往发现通过针灸刺激促进脑缺血局部血管新生可认为是目前有效增加脑血流量的一种可行方法。
　　 研究表明,脑血管闭塞以后缺血区血管增生,其增生的程度和范围直接关系到半暗带血流的改善,影响神经元生理功能的恢复。脑血管闭塞以后,缺血区血管增生,有自发形成侧支循环趋向,但不足以代偿原有的血供,缺血得不到纠正。结合导师以往的研究表明电针对促进局灶性脑缺血大鼠脑血管新生有一定的作用,但其影响血管新生的作用因子和作用因素众多。故本课题以MCAO再灌注大鼠为模型,观察脑缺血再灌注后不同时段电针“百会”、“水沟”、双侧“足三里”穴对大脑皮质层HGF、HIF-1α表达的影响,从血管新生角度进一步探讨电针有效保护和改善脑缺血脑损伤作用机制。
　　 方法：采用Longa的线栓改良法制备大鼠右侧缺血再灌注模型,挑选健康成年SD大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术对照组、缺血再灌注模型对照组(按缺血1h后再灌注1/2d、1d、2d、4d、7d分为五个亚组)、电针治疗组(按缺血1h后再灌注1/2d、1d、2d、4d、7d五个亚组加电针治疗五个亚组),正常组和假手术对照组,其每组各10只,模型对照组和治疗组中每个亚组各10只SD大鼠。正常对照组,模型对照组、假手术对照组均不予治疗,电针组采用韩式电针仪以疏密波,2Hz/15Hz,30min,取“百会”,“水沟”,双侧“足三里”治疗,早晚各一次,每隔12h治疗一次。每次治疗完后均记录各组及亚组SD大鼠的神经症状学评分。按缺血再灌各时间快速多聚甲醛心脏内固定,并迅速分离出已固定好的大脑,取视交叉平面前后2mm部分,做石蜡包埋切片。常规处理,各组切片经过HE染色后在光镜下从形态学角度观察大鼠脑缺血组织前后的改变。每组切片常规处理后采用免疫组化S-ABC法光镜下观察各组大鼠脑皮质部的CD31、HGF、HIF-1α阳性表达,每张脑切片均随机选取五个10×40倍视野观察并进行计数。所得出的实验数据用均数士标准差(x-±s)表示,方差齐性检测后把所有数据输入计算机用SPSS18.0统计软件进行统计分析后结果亦用均数士标准差(x-±s)表示,两组间比较采用t检验。
　　 结果：(1)行为学评分观察:模型组与电针组均出现较明显的神经损伤症状,电针组神经症状学评分再灌注后1/2d、1d、2d、4d、7d组分别和模型组相比,症状明显减轻。
　　 (2)HE染色:正常组和假手术组没有见到神经元变性或坏死和胶质细胞的增生。模型组的神经细胞坏死面积总体上要大于电针组,但是胶质细胞的增生小于电针组;电针组的血管增生速度要明显快于模型组。
　　 (3)微血管密度:正常组和假手术组大鼠脑组织中几乎无CD31阳性表达,模型组CD31微血管在缺血再灌注1d迅速上升,持续升高至再灌注7d。缺血区周围CD31阳性表达明显增多,梗死灶周围的小血管内皮细胞胞浆呈棕黄色,排列密集,呈强阳性表达。电针组与模型组表达基本一致,但更加广泛,在相对应时间段内,电针组与模型组比较均有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (4)HGF在大鼠脑缺血区皮质的表达:正常组和假手术组大鼠脑组织中只有少量HGF阳性表达;模型组、电针组阳性表达明显增多,与正常组和假手术组比较,差别有统计学意义(p＜0.05),其中7d达到高峰;在相对应的时间段内,电针组的阳性表达高于模型组,差异有统计学意义(p＜0.05或P＜0.01),电针能上调脑缺血再灌注大鼠脑内HGF的表达。
　　 (5)HIF-1α在大鼠脑缺血区皮质的表达:正常组和假手术组大鼠脑组织中只有少量HIF-1α阳性表达,模型组、电针组阳性表达明显增多(P＜0.05),其中7d达到高峰;在相对应的时间段内,电针组的阳性表达高于模型组,差异有统计学意义(p＜0.05或P＜0.01),电针能上调脑缺血再灌注大鼠脑内HIF-1α的表达。
　　 结论：电针“百会”,“水沟”,“足三里”对局灶性脑缺血再灌大鼠脑损伤具有一定的神经保护作用—能较有效地改善大鼠脑缺血后的神经症状学评分,能促进缺血区及周边的脑血管新生。其作用机制可能为电针增加了大鼠缺血区HGF、HIF-1α表达的上调,从而促进了缺血区及周边的脑血管增生。